Polymerase Chain Reaction, e tsejoang haholo e le PCR, e emela e 'ngoe ea likhatelopele tsa bohlokoa tsa theknoloji nalaneng ea baeloji ea limolek'hule. E thehiloe ka bo-1980, mokhoa ona o fetohile ho tloha ts'ebetsong e khethehileng ea laboratori ho ea ho sesebelisoa sa mantlha se sebelisoang tlhahlobong ea bongaka, mahlale a forensic, le lipatlisiso tsa lefutso. Ka ho lumella bo-rasaense ho nka sampole e nyane ea DNA le ho e holisa hore e be likopi tse limilione, PCR e nolofalelitse ho ithuta liphatsa tsa lefutso ka botlalo, ho lemoha likokoana-hloko ka nepo e feteletseng, le ho tseba matšoao a liphatsa tsa lefutso ao pele a neng a sa bonahale mekhoeng e tloaelehileng ea tlhahlobo.
Ts'ebetso ea PCR ke mokhoa oa laboratori o sebelisetsoang ho etsa likopi tse ngata tsa karolo e itseng ea DNA ka potoloho ea phetoho ea mocheso, e kenyelletsang denaturation, annealing, and extension, e tsamaisoang ke mochine o khethehileng oa PCR le DNA polymerase e tsitsitseng mocheso.
Ho utloisisa ho rarahana ha ts'ebetso ea PCR ho bohlokoa bakeng sa litsebi tsa laboratori, bafuputsi ba tsa bongaka, le baetsi ba indasteri ba amehang lisebelisoa tsa tlhahlobo. Ha tlhoko ea tlhahlobo ea limolek'hule e potlakileng le e nepahetseng e ntse e tsoela pele ho hola lefatšeng ka bophara, ts'epahalo ea Mochini oa PCR o fetoha motheo oa liphetho tse atlehileng tsa laboratori. Sengoliloeng sena se fana ka tataiso e felletseng ea mehato, lithempereichara le litlhoko tsa mochini tsa ts'ebetso ea PCR ho netefatsa ntlafatso ea boleng bo holimo ea DNA le liphetho tse matla tsa liteko.
Lethathamo la Kakaretso ea Sengoloa
| Karolo |
Kakaretso |
| PCR ke eng? |
PCR ke mokhoa oa baeloji ea limolek'hule o sebelisoang ho holisa ka mokhoa o hlakileng tatelano e khethehileng ea DNA bakeng sa lits'ebetso tse fapaneng tse tlase. |
| Ho hlokahala eng bakeng sa PCR? |
PCR e atlehileng e hloka template ea DNA, li-primers, nucleotide, DNA polymerase e tsitsitseng, le sebaesekele se phahameng sa mocheso o phahameng. |
| Mehato e 4 ea PCR ke efe? |
Ts'ebetso e latela tatellano e hlakileng ea ho qala, denaturation, annealing, le katoloso ho habeli litaba tsa DNA potolohong ka 'ngoe. |
| Mehato ea mochini oa PCR ke efe? |
Thepa e iketsetsa phetoho e nepahetseng ea mocheso, ho netefatsa hore liphetoho tsa biochemical li etsahala ka nako e hlokahalang. |
| Mocheso o fe o sebelisoang bakeng sa mohato oa denature? |
Lithempereichara tse phahameng, tseo hangata li leng pakeng tsa 94°C le 98°C, li sebelisoa ho pshatla libonto tsa haedrojene le ho arola DNA e meloho e habeli. |
| Ho etsahala'ng nakong ea ts'ebetso ea ho nosetsa? |
Nakong ena, mocheso o theoleloa ho lumella li-primers hore li tlamahane ka ho khetheha tatellanong ea tsona e tlatselletsang ho DNA e nang le mela e le 'ngoe. |
| Mocheso o fe o sebelisoang bakeng sa mohato oa katoloso? |
Mohato ona hangata o hlaha ho 72 ° C, mocheso o nepahetseng bakeng sa Taq polymerase ho kopanya khoele e ncha ea DNA. |
| Mocheso oa mocheso oa PCR ke ofe? |
Phallo e kenyelletsa mokhoa o potlakileng oa ho palama baesekele oa mocheso o phahameng, o tlase, le o mahareng o iphetang ho fihlela mahloriso a batloang a fihlelleha. |
PCR ke eng?
PCR, kapa Polymerase Chain Reaction, ke mokhoa o fetolang oa baeloji ea limolek'hule o etselitsoeng ho hlahisa ka potlako likopi tse limilione ho isa ho libilione tsa sampole e itseng ea DNA.
Kokong ea eona, PCR e sebetsa e le ' bioloji photocopier' Pele e qaptjoa, ho holisa DNA e ne e le ts'ebetso e liehang le e boima e kenyelletsang ho kopanngoa ha DNA hore e be baktheria. Ka ho fihla ha Mochini oa PCR , joale bafuputsi ba khona ho khetholla mofuta o itseng oa lefutso kapa karolo ea genome ebe ba e holisa ka mor'a lihora tse seng kae. Bokhoni bona bo bohlokoa hobane litlhahlobo tse ngata tsa biochemical li hloka palo e kholo ea DNA ho fana ka letšoao le ka lekanyetsoang, 'me lisampole tsa tlhaho hangata li fana ka lipalo feela.
Ho tenyetseha ha theknoloji ena ho bonahala mefuteng ea eona e fapaneng ea ts'ebeliso ho liindasteri tse fapaneng. Libakeng tsa tleliniki, e sebelisetsoa ho bona bongata ba vaerase, joalo ka tlhahlobo ea COVID-19 kapa tlhahlobo ea HIV. Ho tsa forensics, e lumella bafuputsi ho khetholla batho ho tsoa ho lisampole tse nyane tsa lintho tsa tlhaho. Lefapheng la indasteri, PCR e netefatsa bohloeki ba lihlahisoa tsa lijo le ho lemoha lintho tse phelang tse fetotsoeng ka liphatsa tsa lefutso. Ho utloisisa melao-motheo le litšenyehelo tsa theknoloji ea PCR li bohlokoa bakeng sa lilaboratori tse batlang ho ntlafatsa bokhoni ba tsona ba ho hlahloba.
Ho hlokahala eng bakeng sa PCR?
Karabelo e atlehileng ea PCR e hloka likarolo tse hlano tsa mantlha: template ea DNA, li-primers tse khethehileng, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), DNA polymerase e tsitsitseng mocheso (joaloka Taq), le tharollo e khethehileng ea buffer.
Setšoantšo sa DNA se sebetsa e le polane ea mantlha eo u lakatsang ho e kopitsa. Li-primers ke likotoana tse khutšoane tsa maiketsetso tsa DNA tse etselitsoeng tloaelo ho ts'oana le qalo le pheletso ea tatellano ea sepheo. Ntle le tsena, DNA polymerase e ne e ke ke ea tseba hore na e qale hokae ho haha khoele e ncha. Li-dNTP (A, T, C, le G) ke li-blocks tse tala tse sebelisoang ke enzyme ho etsa ketane e ncha ea DNA.
Ho bohlokoa ka ho tšoanang ke tikoloho eo karabelo e etsahalang ho eona. The buffer e fana ka tikoloho e tsitsitseng ea lik'hemik'hale, haholo-holo e shebaneng le pH le bongata ba li-ion tsa magnesium, tseo e leng li-cofactors tsa bohlokoa bakeng sa enzyme ea DNA polymerase. Qetellong, ts'ebetso ea 'mele ea karabelo e hloka hore ho be le sebaesekele se phahameng sa mocheso, se atisang ho bitsoa mochine oa PCR , o laolang ka ho toba liphetoho tse potlakileng tsa mocheso tse hlokahalang ho qala mohato ka mong oa karabelo.
Likarolo tsa bohlokoa tsa Motsoako oa PCR
Template DNA : Mohlala o nang le tatelano ea sepheo.
DNA Polymerase : Hangata Taq polymerase, e lulang e sebetsa ka mocheso o phahameng.
Li-Primers : Tsoela pele 'me u khutlisetse morao likhoele tse hlalosang meeli ea ho holisa.
dNTPs : Metheo e mene ea li-nucleotide e sebetsang e le 'inki' bakeng sa mochine o kopitsang.
Buffer le Ions : E boloka ts'ebetso ea enzymatic le botsitso.
Mehato e 4 ea PCR ke efe?
Ts'ebetso ea PCR e na le mekhahlelo e mene ea mantlha ea ts'ebetso: Qalo, Denaturation, Annealing, le Extension (e tsejoang hape e le Elongation).
Mokhahlelo oa pele, Initialization, ke ketsahalo ea nako e le 'ngoe moo kamore ea karabelo e futhumatsang mocheso o phahameng ho etsa bonnete ba hore DNA polymerase e sebetsa ka botlalo le hore litšila leha e le life ha li fokotsehe. Ka mor'a sena, potoloho ea Denaturation e qala, moo DNA e nang le likarolo tse peli e arohanang. Sena se lateloa ke Annealing, moo li-primers li fumanang lipehelo tsa tsona, 'me qetellong Katoloso, moo DNA e ncha e entsoeng teng. Potoloho ena ea mehato e meraro (Denaturation, Annealing, Extension) e phetoa makhetlo a 25 ho isa ho a 40.
Hobane palo ea DNA e imena habeli ka potoloho e 'ngoe le e 'ngoe e atlehileng, khōlo e eketseha ka sekhahla. Ka mohlala, ka mor’a lipotoloho tse 30, molek’hule e le ’ngoe ea DNA e ka fetoloa likopi tse fetang bilione. Sena se sebetsa hantle ke sona se etsang libaesekele tsa sejoale-joale tsa laboratori tsa mocheso li bohlokoa haholo bakeng sa mahlale a sejoale-joale. Ntle le li-blocks tsa ho futhumatsa le ho pholisa ka lebelo le phahameng tse fumanoang mochine oa boleng bo phahameng oa PCR , mokhoa ona o ne o tla lieha haholo bakeng sa tšebeliso e sebetsang libakeng tse phahameng tsa tlhahlobo ea tlhahlobo.
Mehato ea mochini oa PCR ke efe?
Mehato ea mochini oa PCR e kenyelletsa ho palama baesekele ea othomathike ea mocheso ka taolo e nepahetseng ea elektroniki ea block ea mocheso, ho laola sekhahla sa marang-rang, nako ea ho ts'oara, le ho pholisa ho qetela.
Mochini oa PCR o sebetsa ka ho sebelisa likarolo tsa Peltier ho futhumatsa ka potlako le ho pholisa tšepe e ts'oereng methapo ea methapo. 'Mehato' ho latela pono ea mochini e kenyelletsa 'Ramp,' e leng lebelo la phetoho lipakeng tsa mocheso, le 'Hold,' e leng nako eo mochini o bolokang mocheso o itseng. Mechini ea boemo bo holimo e etselitsoe ho ba le litefiso tse potlakileng haholo tsa ho fokotsa nako e sebelisoang phetohong, e fokotsang kotsi ea ho tlama kapa ho senyeha ha enzyme.
Software ka har'a mochini e lumella basebelisi ho hlophisa liprothokholo tse rarahaneng. Sena se kenyelletsa mocheso oa pele oa ho futhumatsa, li-loops tse pheta-phetoang tsa mekhahlelo e meraro e meholo, le mohato oa ho qetela oa ho tšoara mocheso o batang (hangata ke 4 ° C) ho boloka lisampole ho fihlela setsebi se khona ho li fumana. Likhokahano tsa sejoale-joale tsa dijithale mochining oa PCR le tsona li lumella ho lekola karabelo ea nako ea nnete, ho netefatsa hore boemo ba mocheso bo ntse bo lateloa hantle joalo ka ha bo reriloe bakeng sa ho ikatisa ho hoholo.
Mocheso o fe o sebelisoang bakeng sa mohato oa denature?
Mohato oa denaturation hangata o sebelisa mocheso o pakeng tsa 94°C le 98°C ho thusa ho khaoha ha maqhama a haedrojene lipakeng tsa likhoele tsa DNA.
Ha mocheso ona o feteletseng, sebopeho sa double-helix sa DNA se fetoha se sa tsitsang. Maqhama a haedrojene a tšoarang lipara tsa adenine-thymine le cytosine-guanine hammoho lia qhibiliha, 'me ho be le mefuta e 'meli e ikemetseng ea DNA. Ena ke tlhokahalo ea bohlokoa bakeng sa mehato e latelang, kaha li-primers le enzyme ea DNA polymerase li ka sebelisana feela le litempele tse nang le likhoele tse le 'ngoe. Haeba mocheso o le tlase haholo, DNA e ke ke ea arohana ka ho feletseng, e leng se lebisang ho hlōleheng kapa ho se sebetse ha matla a ho hōlisa.
Leha ho le joalo, ho boloka mocheso ona ho hloka DNA polymerase e matla haholo. Ke ka lebaka leo ho sibolloa ha Taq polymerase, e arohaneng le baktheria e ratang mocheso Thermus aquaticus , e bile phetoho e khōlō. Li-enzyme tse tloaelehileng li ne li tla senyeha ho 95 ° C, empa Taq e ntse e sebetsa. Li laboratori li tlameha ho netefatsa hore mochini oa bona oa PCR o fana ka mocheso o ts'oanang lilibeng tsohle ho thibela 'mabala a batang' moo denaturation e ka hlolehang, e leng tšobotsi ea bohlokoa ea lisebelisoa tsa boleng bo holimo tsa baeloji ea limolek'hule.
Ho etsahala'ng nakong ea ts'ebetso ea PCR?
Nakong ea mohato oa ho koala, mocheso o theoleloa ho pakeng tsa 50 ° C le 65 ° C, e leng se lumellang li-primer tsa DNA hore li tlamahane le tatellano ea tsona ea litempele tsa DNA tse nang le moeli o le mong.
Mohato ona ha ho pelaelo hore ke karolo e thata ka ho fetisisa ea ts'ebetso ea PCR. Mocheso o khethehileng o sebelisoang o itšetlehile ka mocheso o qhibilihang (Tm) oa li-primers tse sebelisoang. Haeba mocheso o phahame haholo, li-primers li ke ke tsa tlama template. Haeba e le tlase haholo, li-primers li ka tlama ho tatellano e 'karolo' e ts'oanang, e lebisang ho ntlafatso e sa tobang le liphetho tse bohlasoa. Mochine oa PCR o tlameha ho khona ho otla mocheso ona oa sepheo ka tekanyo e phahameng ea ho nepahala (hangata ka har'a 0.1 ° C).
Nako ea mohato oa ho koala hangata ke metsotsoana e 20 ho isa ho e 40. Nakong ea fensetere ena e khuts'oane, li-primers li tsamaisa motsoako oa limolek'hule ebe li thula sebaka seo ho shebiloeng ho sona. Hang ha li-primers li se li tsitsitse, li fana ka sebaka sa ho qala bakeng sa DNA polymerase ho qala ho eketsa li-nucleotide. Khokahano ena e nepahetseng ke eona e lumellang ho lemoha liphetoho tse itseng tsa lefutso kapa likokoana-hloko ka har'a sampole e rarahaneng ea baeloji, ho etsa matsete ho mechini ea profeshenale ea ho hlahloba mafu ke ntho e tlang pele bakeng sa lilaboratori tsa kliniki.
Mocheso o fe o sebelisoang bakeng sa mohato oa katoloso?
Mohato oa ho atolosa hangata o etsoa ho 72 ° C, e leng mocheso o nepahetseng ka ho fetisisa bakeng sa DNA polymerase e tsitsitseng mocheso ho kopanya DNA strand e ncha.
Ka 72°C, enzyme ea DNA polymerase e sebetsa hantle haholo. E qala sebakeng sa pele 'me e qala ho eketsa dNTP qetellong ea 3' ea primer, e tsamaea haufi le khoele ea template. Enzyme 'e bala' thempleite ebe e beha motheo oa tlatsetso khoeleng e ncha. Ka mohlala, haeba template e na le Adenine, polymerase e eketsa Thymine. Lebelo la karabelo ena lea tsoteha; Taq polymerase e ka eketsa li-base pair tse ka bang 1,000 ka motsotso.
Bolelele ba nako bakeng sa mohato ona bo itšetlehile ka bolelele ba karolo ea DNA e kopitsoang. Haeba tatellano ea tatellano e le bolelele ba lipara tse 1,000, mohato oa katoloso o ka beoa motsotso o le mong. Haeba sepheo se le khuts'oane, nako e ka fokotsoa ho boloka nako ea ho sebetsa ka kakaretso. Ho netefatsa hore mochini oa PCR o boloka mocheso o tsitsitseng oa 72 ° C ho pholletsa le mohato ona ke habohlokoa bakeng sa ho phethoa ha likhoele tsa DNA tse telele.
Mocheso oa mocheso oa PCR ke ofe?
Mocheso oa mocheso oa PCR o latela potoloho e pheta-phetoang ea mocheso o phahameng oa mocheso, ho fokotsa mocheso o tlaase, le katoloso ea mocheso o itekanetseng, ho theha 'sawtooth' profile ea mocheso.
Phallo ena e etselitsoe ho eketsa tsoelo-pele ea geometri ea bongata ba DNA. Ka mokhoa o tloaelehileng, mochine o qala ho 95 ° C bakeng sa metsotso ea 2 (Initial Denaturation), ebe o kena ka loop: 95 ° C bakeng sa metsotsoana ea 30, 55 ° C metsotsoana ea 30, le 72 ° C metsotsoana ea 60. Loop ena e pheta makhetlo a 30. Qetellong, ho na le 'katoloso ea ho qetela' ka 72 ° C bakeng sa metsotso e 5-10 ho netefatsa hore DNA eohle e nang le mela e le 'ngoe e pota-potiloe ka ho feletseng pele mochine o bata ho 4 ° C bakeng sa polokelo.
Ho nepahala ha phallo ena ea mocheso ho ama ka kotloloho chai le bohloeki ba sehlahisoa sa PCR. Haeba phallo e sa tsitsane, enzyme e ka lahleheloa ke ts'ebetso kapa li-primer dimers li ka theha 'primer dimers', tseo ha e le hantle e leng lintho tse se nang thuso tsa karabelo. Ka lebaka lena, ho lekanngoa le ho tšoana ha mocheso oa mochine oa PCR ke lintlha tsa bohlokoa ka ho fetisisa bakeng sa laboratori leha e le efe e etsang tlhahlobo ea limolek'hule kapa lipatlisiso.
Kakaretso Lethathamo la Phallo ea Mocheso
| Mokhahlelo |
Mocheso o Tloaelehileng |
Morero |
| Ho qala |
94°C – 96°C |
E kenya tšebetsong enzyme, e hlahisa DNA e rarahaneng. |
| Denaturation |
94°C – 98°C |
E arola DNA e likhoele tse peli hore e be khoele e le 'ngoe. |
| Annealing |
50°C – 65°C |
E lumella li-primers ho tlamahane ho latela tatellano. |
| Katoloso |
72°C |
DNA polymerase e kopanya likhoele tse ncha tsa DNA. |
| Qeto ea ho Qetela |
4°C – 10°C |
Ho boloka nako e khutšoanyane ea sehlahisoa se matlafalitsoeng. |
Qetello
Polymerase Chain Reaction ke sesebelisoa se setle le se matla se fetotseng sebopeho sa mahlale a baeloji. Ka ho latela mehato e hlokolosi ea denaturation, annealing, and extension, bo-ramahlale ba ka notlolla makunutu a ka hare ho DNA, ba fana ka likarabo tsa lipotso tse rarahaneng tsa bongaka le tsa forensic. Katleho ea ts'ebetso ena e itšetlehile haholo ka boleng ba li-reagents le ho nepahala ha mochine oa PCR o sebelisetsoang ho etsa lipotoloho tsa mocheso.
Bakeng sa laboratori leha e le efe e batlang ho finyella liphello tse tsitsitseng le tse ka tšeptjoang, ho utloisisa likaroloana tsa taolo ea mocheso le tsamaiso ea potoloho ke habohlokoa. Hore na o etsa lipatlisiso tsa mantlha kapa tlhahlobo e phahameng ea bongaka, khetho ea lisebelisoa le ho latela melaoana e ntlafalitsoeng li tla hlalosa ho nepahala ha mosebetsi oa hau. Bakeng sa ba thahasellang ka lehlakoreng la thepa ea ho theha lab ea molek'hule, ho hlahloba litšenyehelo le litlhaloso tsa tekheniki tsa litsamaiso tsa sejoale-joale tsa PCR ke mohato o latelang o utloahalang oa ho ntšetsa pele bokhoni ba hau ba tlhahlobo.
