ʻO ka mīkini PCR he mea hana hoʻokolohua e hoʻohana ana i ke kaʻa kaʻa wela kūpono e hoʻomaʻamaʻa i ka Polymerase Chain Reaction, e hiki ai i ka hoʻonui wikiwiki ʻana i nā kaʻina DNA a i ʻole RNA kikoʻī no ka nānā ʻana. Ma ka hana ʻana i ka hoʻomehana a me ka hoʻoluʻu ʻana i koi ʻia no ka denaturation, annealing, a me ka hoʻonui ʻana, hāʻawi ka mīkini PCR hou i ka kūlike a me ka wikiwiki e pono ai no nā noi noiʻi a me nā noiʻi.
He mea koʻikoʻi ka hoʻomaopopo ʻana i ka ʻenehana kumu o kēia mau mīkini no nā luna hoʻokolohua, nā mea noiʻi, a me nā ʻoihana lapaʻau e ʻimi nei e hoʻopaʻa i kā lākou mau hana diagnostic. Mai ka paʻakikī o nā mea hoʻomehana Peltier a hiki i nā optics kiʻekiʻe o nā ʻōnaehana manawa maoli, ʻo ka ʻenekinia ma hope o ka hoʻonui ʻana i ka DNA he paʻakikī a hoihoi. Hāʻawi kēia ʻatikala i kahi mākaʻikaʻi piha o ka ʻenehana PCR, kona mau ʻāpana mechanical, a me kāna mau noi like ʻole i ka ʻoihana olakino honua.
ʻŌlelo Kūlana Kūlana
| Māhele |
Hōʻuluʻulu manaʻo |
| Pehea e hana ai ka mīkini PCR |
He wehewehe no ke kaʻina holo kaʻa uila wela ʻekolu (denaturation, annealing, a me ka hoʻonui) e hiki ai i ka ulu ʻana o ka DNA exponential. |
| Nā ʻāpana kumu o ka ʻenehana PCR |
ʻO kahi haʻihaʻi ʻenehana o nā poloka hoʻomehana, nā mea Peltier, a me nā mea ʻike e hōʻoia i ka like ʻana o ka wela a me ka pololei. |
| Nā ʻano o nā mīkini PCR a me kā lākou hoʻohana ʻana |
He hoʻohālikelike ma waena o nā kaʻa kaʻa wela maʻamau, nā ʻōnaehana Real-Time (qPCR), a me nā ʻenehana Digital PCR (dPCR). |
| ʻO ke koʻikoʻi o ka hoʻohālikelike wela |
ʻO ka nānā ʻana i ke kumu o ka hoʻohālikelike ʻana o ka mahana ma nā pūnāwai a pau ke kumu koʻikoʻi loa no nā hualoaʻa hoʻokolohua SEO-optimized hilinaʻi. |
| Nā noi i nā Diagnostics hou |
Pehea e hoʻohana ʻia ai ka ʻenehana PCR i ka hoʻāʻo ʻana i nā maʻi infectious, oncology, a me ka ʻike forensic. |
| Manaʻo no ka mālama ʻana a me ka hoʻonui ʻana |
ʻO nā hana maikaʻi loa no ka calibrating a me ka mālama ʻana i nā lako PCR e hōʻoia i ka pololei a me ka hana lōʻihi. |
Pehea e hana ai ka mīkini PCR
ʻO ka hana koʻikoʻi o ka mīkini PCR e pili ana i ke kaʻa ʻana i ʻekolu mau ʻāpana wela e hoʻomaʻamaʻa i ka DNA denaturation, primer annealing, a me ka hoʻonui enzymatic, e hopena i ka hoʻopiʻi exponential o nā mea genetic i manaʻo ʻia.
Aia ma ka pu'uwai o ke ka'ina hana ka pō'ai wela. I ka wā mua, denaturation, hoʻomaʻamaʻa ka mīkini PCR i ka hui ʻana i ka 94 a 98 degere Celsius. Hoʻopau kēia wela kiʻekiʻe i nā paʻa hydrogen ma waena o nā kaula ʻelua o ka DNA double helix, a loaʻa i ʻelua mau hiʻohiʻona DNA hoʻokahi. He mea koʻikoʻi ka pololei ma kēia pae, no ka mea, ʻaʻole lawa ka wela e hoʻokaʻawale i nā kaula, ʻoiai hiki i ka wela ke hōʻino i ka enzyme polymerase paʻa wela.
ʻO ka lua o ka hana he annealing, kahi e hoʻohaʻahaʻa ʻia ai ka mahana ma waena o 50 a me 65 degere Celsius. ʻAe kēia i nā kaʻina DNA pōkole i kapa ʻia ʻo primers e hoʻopaʻa i kā lākou mau kaʻina hoʻohui ma nā ʻano hoʻohālike DNA i kau ʻia hoʻokahi. ʻO ka mahana kūpono e pili ana i ka wela hoʻoheheʻe o nā primers i hoʻohana ʻia. Pono e hiki i ka kiʻekiʻe mīkini PCR ke hiki a hoʻopaʻa i kēia wela kikoʻī me ka wikiwiki e pale i ka paʻa ʻole kikoʻī, hiki ke alakaʻi i nā hopena kūpono ʻole a i ʻole ' walaʻau ' i ka ʻikepili.
ʻO ka mea hope loa, hiki i ka manawa hoʻonui, maʻamau ma 72 degere Celsius. ʻO kēia ka mahana maikaʻi loa no ka DNA polymerase (ʻo ia hoʻi ʻo Taq polymerase) e hoʻohui i kahi kaula DNA hou ma o ka hoʻohui ʻana i nā nucleotides i nā kumu mua. Ke hoʻi hou ka pōʻai, pālua ka helu o nā kope DNA i kēlā me kēia manawa. No ka hoʻomaopopo maikaʻi ʻana i ka hoʻopukapuka kālā e pono ai no kēia ʻenehana, hiki iā ʻoe ke ʻimi i nā kikoʻī e pili ana He aha ka Mīkini PCR a me kāna kumukūʻai e loiloi i ka waihona kālā e pono ai no nā ʻāpana hana kiʻekiʻe.
ʻO ka Mechanics of Exponential Growth
Helu 1: 2 kope
Helu 10: 1,024 kope
Helu 30: Ma luna o 1 biliona kope
Nā ʻāpana kumu o ka ʻenehana PCR
Ke hilinaʻi nei ka maikaʻi ʻenehana o ka mīkini PCR i kāna lako i loko, ʻo ka mea nui nā mea hoʻomehana Peltier, ke kālā a i ʻole ke alumini thermal block, a me ka polokalamu hoʻokele maʻalahi e hoʻokele i nā hoʻololi wela wikiwiki.
ʻO ka mea koʻikoʻi ʻo ia ka element Peltier, kahi pahū wela ikaika e hoʻoneʻe i ka wela mai kekahi ʻaoʻao a i kekahi ʻaoʻao e kū'ē i ka gradient wela. ʻAe kēia i ka hoʻomehana ʻana a me ka hoʻomaha ʻana mai kahi kumu hoʻokahi, e hiki ai i ka mīkini PCR ke hoʻololi i nā mahana i kekona. ʻO ka wikiwiki o kēia mau hoʻololi ʻana—i ʻike ʻia ʻo ka 'ramp rate'—e hoʻoholo pololei i ka pono holoʻokoʻa a me ka holo ʻana o ka hale hana. Hōʻike pinepine nā mīkini kiʻekiʻe i nā poloka kālā i uhi ʻia i ke gula e hoʻonui i ka conductivity thermal.
Hoʻokumu nā mea ʻike a me nā microprocessors i ka 'lolo' o ka hāmeʻa. Mālama kēia mau ʻāpana i ka mahana o ka poloka i ka manawa maoli, e hoʻoponopono ana i ka mana i nā mea Peltier e pale ai i ka overshooting wela a i ʻole undershooting. Hoʻohana nā ʻōnaehana hou i nā mea ʻike he nui ma ka poloka e hōʻoia i ka ʻike maikaʻi ʻana o kēlā me kēia laʻana i nā kūlana wela like. No nā ʻoihana e nānā ana e hoʻomaikaʻi i kā lākou hāmeʻa, koho i kahi hilinaʻi ʻO ka mea hoʻolako mīkini PCR e hōʻoia i ka loaʻa ʻana o ka ʻenehana sensor hou a me ka ʻenehana ikaika.
ʻO ka poʻi wela kekahi mea pono akā i ka nānā pinepine ʻia. Ma ka mālama ʻana i ka uhi ma kahi mahana ʻoi aku ka kiʻekiʻe ma mua o ka wela o ka poloka kiʻekiʻe (maʻamau ma kahi o 105 degere Celsius), pale ka mīkini i ka evaporation a me ka condensation o ka hui ʻana ma nā pāpale paipu. Hoʻomaopopo kēia i ka hoʻomau mau ʻana o ka ʻike o nā reagents i loko o nā pōʻai 30 a 40, he mea koʻikoʻi ia no ke koena kemika o ka hopena.
Nā hiʻohiʻona Lako Nui
Palena Thermal: Loaʻa maʻamau i nā luawai 96 a i ʻole 384.
Ramp Rate: Ka wikiwiki o ka hoʻololi ʻana o ka mahana (ana ʻia ma °C/s).
Pono: Pehea ka pili ana o ka wela o ka poloka i ka wahi hoonoho.
Kaulike: ʻO ke kūlike o ka mahana ma nā pūnāwai a pau.
Nā ʻano o nā mīkini PCR a me kā lākou hoʻohana ʻana
Hoʻohana ka biology molecular hou i ʻekolu mau ʻano o ka ʻenehana PCR: Gradient PCR no ka hoʻonui ʻana, Real-Time PCR (qPCR) no ka helu ʻana, a me Digital PCR no ka pololei loa i ka ʻike allele.
ʻO ka Standard Thermal Cyclers ka mea maʻamau i hoʻohana ʻia i ka noiʻi kumu a me ka hoʻonaʻauao. Hoʻolālā ʻia kēia mau mīkini no ka PCR 'end-point', ʻo ia hoʻi, ʻike ʻia nā hopena ma hope o ka pau ʻana o nā pōʻai, maʻamau ma o ka electrophoresis gel. ʻO kahi hoʻololi o kēia ka mīkini PCR Gradient , e hiki ai i ka mea hoʻohana ke hoʻonohonoho i nā mahana like ʻole ma waena o ka poloka i ka holo hoʻokahi. He mea maikaʻi loa kēia no ka hoʻoholo ʻana i ka mahana annealing maikaʻi loa no nā primers hou, e mālama ana i nā hola o ka hoʻāʻo ʻana-a-hewa.
Hōʻike nā mīkini PCR manawa maoli (qPCR) i kahi lele ʻenehana koʻikoʻi. Aia kēia mau mea i kahi ʻōnaehana optical i hoʻohui ʻia (nā laser a i ʻole nā LED a me nā mea ʻike) e nānā i ka fluorescence o nā mea hoʻohālike DNA i ka wā o ke kaʻina hoʻonui. ʻAe kēia i ka nānā ʻana i ka 'quantitative', kahi e hiki ai i nā mea noiʻi ke hoʻoholo pololei i ka nui o kahi kaʻina DNA kikoʻī i loaʻa i ka hāpana kumu. ʻO kēia ʻenehana ke kūlana gula no ka hoʻāʻo ʻana i ka load viral a me nā haʻawina hōʻike gene. Ka hoomaopopo ana i ka ke kumu kūʻai a me nā kikoʻī o nā ʻāpana PCR i ka wā e hoʻoholo ai ma waena o kahi kaʻa kaʻa maʻamau a me kahi ʻōnaehana qPCR holomua. Pono
ʻO Digital PCR (dPCR) ka mea hou loa, e hāʻawi ana i ka helu piha me ka pono ʻole o kahi pihi maʻamau. Hoʻokaʻawale ʻia ka laʻana i mau kaukani kulu liʻiliʻi, a loaʻa ka hopena PCR i kēlā me kēia. Ma ka helu ʻana i ka helu o nā droplets 'positive' versus 'negative', hāʻawi ka mīkini i ka helu pololei loa o nā molekala DNA. Pono kēia no ka ʻike ʻana i nā hoʻololi ʻokoʻa i loko o nā biopsies wai a i ʻole nā mea hoʻohālike kaiapuni kahi i loaʻa ai ka DNA target i nā haʻahaʻa haʻahaʻa loa.
Hoʻohālikelike o nā ʻenehana PCR
| Hiʻona |
PCR maʻamau |
PCR manawa maoli (qPCR) |
PCR kikohoʻe (dPCR) |
| ʻIke ʻana |
Lae-hope |
manawa maoli |
Lae-hope (Loaʻa) |
| Ka helu ana |
Kūlana |
Pili/Nui |
Pau loa |
| ʻO ka ʻike |
Kaumaha |
Kiʻekiʻe |
Kiʻekiʻe-Kiʻekiʻe |
| Paʻakikī |
Haʻahaʻa |
Kaumaha |
Kiʻekiʻe |
ʻO ke koʻikoʻi o ka hoʻohālikelike wela
ʻO ka like ʻana o ka wela e pili ana i ke kūlike o ka wela ma nā pūnāwai a pau o ka poloka PCR, kahi mea koʻikoʻi e hōʻoia i ka hoʻonui ʻana o kēlā me kēia laʻana i loko o ka pā punawai 96 i ka helu like a hāʻawi i nā hopena reproducible.
Inā ʻoi aku ka maʻalili o ka 0.5 degere Celsius ma mua o ke kikowaena, ʻaʻole hiki i ka DNA i loko o ia mau pūnāwai ke denature loa, a i ʻole hiki ke hoʻopaʻa ʻia nā kumu mua. Ke alakaʻi nei kēia i ka 'well-to-well variation,' hiki ke hōʻino i kahi hoʻokolohua holoʻokoʻa a i ʻole, ʻoi aku ka maikaʻi, alakaʻi i kahi hōʻino wahaheʻe i kahi hoʻonohonoho diagnostic clinical. Hoʻokomo nui nā mea hana o kiʻekiʻe nā mīkini PCR i ka mīkini pololei a me ka hoʻomehana ʻana i nā ʻāpana he nui e hoʻēmi i kēia mau pilikia a hāʻawi i ka like ʻana o ka ʻaoʻao.
Hoʻohana ʻia nā polokalamu algorithm kiʻekiʻe no ka hoʻopaʻi ʻana i ka 'hopena lihi,' kahi e nalowale ai ka wela o nā pūnāwai ma ka ʻaoʻao o ka poloka ma mua o ka wela ma waena. Ma ke kaohi ʻana i nā ʻāpana Peltier ʻokoʻa, hiki i ka mīkini ke hoʻomāhuahua i ka wela i nā ʻaoʻao e mālama i kahi ʻano wela wela. I ka noiʻi ʻana i nā lako, pono ke nānā i a kiʻekiʻe kiʻekiʻe PCR mīkini papa inoa e hoʻohālikelike i ke ʻano o ka mālama ʻana o nā mana ʻokoʻa i ka hoʻokele wela a me ka calibration poloka.
ʻO ka reproducibility ka pōhaku kihi o ka ʻepekema. Inā hana ʻia kahi hoʻāʻo ma Lākana a i Shanghai paha, pono e hāʻawi ka mīkini PCR i ka hana wela like. ʻO ia ke kumu i koi ʻia ai nā kūlana honua a me ka calibration maʻamau no nā lab lapaʻau. ʻO ka mīkini me ka ʻano like ʻole e hoʻopuka i nā waiwai like ʻole ʻo 'Ct' (paepae pōʻaiapuni) ma qPCR, no laila hiki ʻole ke helu pololei i nā ukana viral a i ʻole nā mea hōʻailona genetic ma waena o nā holo ʻokoʻa a i ʻole nā laboratories.
Nā mea e pili ana i ka lokahi
Palekana: ʻOi aku ke kala ma mua o ka alumini no ka hāʻawi ʻana i ka wela.
ʻO ka maikaʻi o Peltier: Hāʻawi nā Peltiers kiʻekiʻe i nā ola lōʻihi a me ka hoʻomehana mau.
Hoʻokomo ʻia ʻo Sensor: Hāʻawi nā mea ʻike he nui i nā manaʻo maikaʻi aʻe no ka loop control.
Nā noi i nā Diagnostics hou
Hoʻohana ʻia ka ʻenehana PCR ma waena o ka ʻike ʻana i nā maʻi infectious, oncology no ka ʻike maka ʻana i ka maʻi kanesa, a me ka ʻepekema forensic, kahi i hoʻohana ʻia ai e hana i nā profile DNA mai nā laʻana biological minute.
I ke aupuni o nā maʻi infectious, mīkini PCR i mea pono loa. ua lilo ka Hāʻawi ia i ka ʻike ʻana i nā pathogens e like me HIV, Hepatitis, a me nā maʻi hanu me ka ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka naʻau a me ka wikiwiki ma mua o nā ʻano moʻomeheu kuʻuna. No ka mea hiki i ka mīkini ke ʻike pololei i ka hele ʻana o ka genome viral, hiki iā ia ke ʻike i kahi maʻi ma mua o ka hoʻomohala ʻana o ka mea maʻi i kahi pane kūlohelohe a i ʻole nā hōʻailona, e ʻae ana i ka hana mua a me ka hoʻokele olakino maikaʻi.
ʻO ka Oncology kahi kahua ʻē aʻe e pōmaikaʻi nui ana mai kēia ʻenehana. Hoʻohana ʻia ʻo PCR e ʻike i nā hoʻololi genetic kikoʻī e pili ana i kekahi mau ʻano maʻi kanesa. ʻAe kēia i ka 'lāʻau lapaʻau pilikino,' kahi e hiki ai i nā kauka ke koho i ka lāʻau lapaʻau maikaʻi loa ma muli o ke ʻano genetic profile o ka ʻōpū. No ka poʻe makemake e pili ana i ke kuleana o ka ʻenehana i ka mālama olakino, heluhelu e pili ana ʻO ke kumukūʻai a me ka pono o nā ʻōnaehana PCR e hāʻawi i ka ʻike i ke ʻano o ke kaulike ʻana o nā halemai i ka ʻenehana ʻokiʻoki me nā kālā hana.
Ke hilinaʻi nei ka ʻepekema Forensic i ka PCR e hoʻonui i ka DNA mai nā hiʻohiʻona hewa, e like me ka lauoho hoʻokahi a i ʻole kahi kulu o ke koko. Ma ka huli ʻana i nā wahi kikoʻī o ka genome kanaka e ʻokoʻa ma waena o nā kānaka (STR), hiki i nā ʻepekema forensic ke hana i kahi manamana lima DNA kūʻokoʻa. Ua hoʻololi kēia ʻenehana i ka ʻōnaehana kānāwai, e hāʻawi ana i nā hōʻike ikaika no ka hoʻopaʻapaʻa a me ka hoʻokuʻu ʻia ʻana o ka mea i hoʻopiʻi hewa ʻia.
Nā ʻāpana noi nui
Nā Kauka Hoʻomaʻamaʻa: ʻO ka hoʻāʻo ʻana i ka pathogen a me ka nānā ʻana i ka prenatal.
Palekana Meaʻai: Ka ʻike ʻana i nā GMO a i ʻole nā mea maʻi e like me Salmonella.
ʻEpekema Kaiapuni: Ka nānā ʻana i nā heluna microbial ma ka lepo a i ʻole ka wai.
Noiʻi: Cloning, sequencing, and gene expression analysis.
Manaʻo no ka mālama ʻana a me ka hoʻonui ʻana
No ka hōʻoia ʻana i ka lōʻihi a me ka pololei o ka mīkini PCR, pono nā laboratories e hoʻokō i nā protocol mālama koʻikoʻi, me ka hoʻomaʻemaʻe poloka maʻamau, ka calibration o ka poʻi, a me ka hōʻoia ʻana i ka wela.
ʻO ka contamination ka ʻenemi nui loa o PCR. Hiki ke hoʻonui ʻia kahi mole o DNA mai kahi holo mua, e alakaʻi ana i nā hopena maikaʻi ʻole. No laila, ka poloka wela o ka mīkini PCR me nā mea hoʻonā DNA-removing kūikawā a i ʻole 10% bleach i ukali ʻia e ka ethanol. pono e hoʻomaʻemaʻe mau ʻia He mea nui hoʻi e hōʻoia i ka hoʻopaʻa ʻia ʻana o nā paipu i mea e pale ai i ka leaka ʻana o ka laʻana i loko o nā pūnāwai, hiki ke ʻino i ka ʻili o ka poloka a keakea i ka hoʻoili wela.
Pono pū ka calibration maʻamau. I ka lōʻihi o ka manawa, hiki ke hoʻohaʻahaʻa nā mea Peltier, e alakaʻi ana i ka lohi o ka ramp a i ʻole ka emi ʻana o ka like ʻana o ka wela. Hoʻohana nā lawelawe calibration ʻoihana i kahi ʻōnaehana 'multiprobe' e ana i ka mahana o kekahi mau luawai i ka manawa hoʻokahi i ka wā hoʻohenehene. Hōʻoia kēia i ka hana ʻana o ka mīkini i loko o nā ʻae ʻana o ka mea hana. No nā labs e ʻimi nei i nā lako paʻa me nā ʻaoʻao mālama maʻalahi, e nīnau i kahi loea Hiki i ka mea hāʻawi lako PCR ke kōkua i ke koho ʻana i nā hiʻohiʻona i hoʻolālā ʻia no ka hoʻohana kaumaha.
ʻAʻole pono e mālama ʻia nā hoʻonui polokalamu. Hoʻokuʻu pinepine nā mea hana i nā mea hou firmware e hoʻomaikaʻi i nā algorithms kaohi wela a i ʻole e hoʻohui i nā hiʻohiʻona hou i ka mea hoʻohana. ʻO ka mālama ʻana i ka polokalamu o ka mīkini i kēia lā e hōʻoia ʻoe e pōmaikaʻi ana i nā loiloi hou loa i ka hoʻokele wela. Eia hou, e hoʻohana mau i nā mea hoʻohana PCR kiʻekiʻe (nā paipu a me nā pā), no ka mea, ua hoʻolālā pono ʻia nā plastics pā lahilahi e hoʻomaʻamaʻa i ka hoʻololi wikiwiki ʻana o ka wela mai ka poloka a i ka hui ʻana.
Ka papa inoa mālama mālama
ʻO kēlā me kēia lā: Holoi i waho a nānā i ka uhi wela.
I kēlā me kēia pule: E nānā i nā pūnāwai no ka ʻōpala a i ʻole leaka; hoʻomaʻemaʻe i ka poloka.
ʻO kēlā me kēia mahina: E holo i kahi hoʻāʻo ʻike ponoʻī inā loaʻa i ka polokalamu.
I kēlā me kēia makahiki: ʻO ka hōʻoia ʻana i ka wela a me ka calibration.
Ka hopena
ʻO ka ʻenehana o ka mīkini PCR he masterclass i ka ʻenekinia pololei a me ke kemika mole. Ma ka hoʻolako ʻana i kahi kaiapuni i hoʻopaʻa ʻia no ka hoʻonui nui ʻana o DNA, ua wehe kēia mau mea i nā mea huna o ka genetic code a hāʻawi i nā mea pono e hakakā ai i nā maʻi maʻi honua, mālama i ka maʻi kanesa, a hoʻoponopono i nā hewa. Ke neʻe nei mākou i nā ʻōnaehana hoʻohui a me nā ʻōnaehana kikohoʻe, ʻoi aku ka pili o nā kumu kumu o ka paikikala wela.
No nā laboratories a me nā keʻena lapaʻau, ʻo ke koho ʻana i ka ʻenehana PCR kūpono ke kaulike o ka wikiwiki, pololei, a me ka uku-pono. Inā he kaʻa kaʻa wela maʻamau no nā kumu hoʻonaʻauao a i ʻole kahi ʻōnaehana manawa maoli no nā diagnostics koʻikoʻi, ʻo ka hoʻomaopopo ʻana i ka mīkini ma hope o ka mīkini ka hana mua i ka loaʻa ʻana o nā hopena hilinaʻi a hopena. ʻO ka wā e hiki mai ana o ka ʻenehana PCR e hoʻohiki ʻoi aku ka wikiwiki o nā hopena, ʻoi aku ka nui o ka lawe ʻana, a me ka ʻike kiʻekiʻe, e hoʻomau ana i kāna kuleana ma ke ʻano he pōhaku kihi o ka holomua ʻepekema.
