Mochini oa PCR ke sesebelisoa sa laboratori se sebelisang baesekele e nepahetseng hantle ho thusa Polymerase Chain Reaction, e nolofalletsang ho holisa ka potlako tatellano e itseng ea DNA kapa RNA bakeng sa tlhahlobo. Ka ho iketsetsa mekhahlelo ea ho futhumatsa le ho pholisa e hlokahalang bakeng sa denaturation, annealing, le katoloso, mochini oa sejoale-joale oa PCR o fana ka botsitso le lebelo le hlokahalang bakeng sa lits'ebetso tsa bongaka le tsa lipatlisiso.
Ho utloisisa mahlale a motheo a mechini ena ho bohlokoa ho baokameli ba laboratori, bafuputsi le litsebi tsa bongaka ba batlang ho ntlafatsa phallo ea bona ea tlhahlobo. Ho tloha bothateng ba lintho tse futhumatsang tsa Peltier ho isa ho li-optics tse tsoetseng pele tsa sistimi ea nako ea nnete, boenjiniere bo ka morao ho ntlafatso ea DNA bo rarahane ebile boa khahla. Sengoliloeng sena se fana ka tlhahlobo e felletseng ea theknoloji ea PCR, likarolo tsa eona tsa mochini, le lits'ebetso tsa eona tse fapaneng indastering ea bongaka ea lefats'e.
Kakaretso ea Sebopeho sa Sengoloa
| Karolo |
Kakaretso |
| Mochini oa PCR o Sebetsa Joang |
Tlhaloso ea mehato e meraro ea mokhoa oa ho palama baesekele e futhumatsang (denaturation, annealing, and extension) e lumellang kholo ea DNA e hlakileng. |
| Likarolo tsa mantlha tsa theknoloji ea PCR |
Karohano ea tekheniki ea li-block tsa ho futhumatsa, likarolo tsa Peltier, le lisensara tse netefatsang ho tšoana le ho nepahala ha mocheso. |
| Mefuta ea Mechini ea PCR le Tšebeliso ea eona |
Papiso lipakeng tsa libaesekele tse tloaelehileng tsa mocheso, litsamaiso tsa Real-Time (qPCR), le theknoloji ea Digital PCR (dPCR). |
| Bohlokoa ba ho Kopana ha Thermal |
Tlhahlobo ea hore na ke hobane'ng ha mocheso o tsitsitseng ho liliba tsohle e le ntlha ea bohlokoa ka ho fetisisa bakeng sa liphetho tse tšepahalang tsa laboratori ea SEO-optimized. |
| Likopo ho Litlhahlobo tsa Kajeno |
Mokhoa oa ho sebelisa theknoloji ea PCR litekong tsa mafu a tšoaetsanoang, oncology, le boitsebahatso ba forensic. |
| Malebela a Tlhokomelo le Ntlafatso |
Mekhoa e metle ea ho lekanya le ho boloka lisebelisoa tsa PCR ho netefatsa ho nepahala le ts'ebetso ea nako e telele. |
Mochini oa PCR o Sebetsa Joang
Ts'ebetso ea mantlha ea mochini oa PCR e kenyelletsa ho palama libaesekele ho pholletsa le libaka tse tharo tse ikhethileng tsa mocheso ho thusa DNA denaturation, primer annealing, le ho atolosoa ha enzymatic, ho bakang phetiso e hlakileng ea liphatsa tsa lefutso tse shebiloeng.
Bohareng ba ts'ebetso ke potoloho ea mocheso. Mokhahlelong oa pele, denaturation, mochini oa PCR o futhumatsa motsoako oa karabelo ho isa ho likhato tse 94 ho isa ho tse 98 tsa Celsius. Mocheso ona o phahameng o senya maqhama a haedrojene pakeng tsa likhoele tse peli tsa DNA double helix, e leng se etsang hore ho be le lithempleite tse peli tsa DNA tse nang le khoele e le 'ngoe. Ho nepahala mothating ona ke habohlokoa, kaha mocheso o sa lekaneng o ke ke oa arola likhoele, athe mocheso o feteletseng o ka senya enzyme ea polymerase e tsitsitseng mocheso.
Mokhahlelo oa bobeli ke oa annealing, moo thempereichara e theoleloang lipakeng tsa 50 le 65 degrees Celsius. Sena se lumella tatellano e khuts'oane ea DNA e bitsoang li-primers ho tlamahana le tatellano ea tsona e tlatselletsang ho litempele tsa DNA tse nang le likhoele tse le 'ngoe. Mocheso o nepahetseng o itšetlehile ka mocheso o qhibilihang oa li-primers tse sebelisitsoeng. Mochini oa boleng bo holimo oa PCR o tlameha ho khona ho fihla le ho tsitsisa mochesong ona o khethehileng ka potlako ho thibela ho tlamahanngoa ho sa tsitsang, ho ka lebisang liphellong tse sa nepahalang kapa 'lerata' ho data.
Qetellong, mohato oa ho atolosa o etsahala, hangata ho likhato tse 72 tsa Celsius. Ena ke mocheso o nepahetseng bakeng sa DNA polymerase (hangata Taq polymerase) ho kopanya DNA strand e ncha ka ho eketsa li-nucleotide ho li-primers. Ha potoloho e ntse e ipheta, palo ea likopi tsa DNA e imena habeli nako le nako. Ho utloisisa hamolemo matsete a lichelete a hlokehang bakeng sa theknoloji ena, o ka hlahloba lintlha tse mabapi le Mochini oa PCR ke Eng le Litšenyehelo tsa Wona ho lekola tekanyetso e hlokahalang bakeng sa likarolo tse sebetsang hantle.
Mechanics of Exponential Growth
Cycle 1: 2 likopi
Cycle 10: 1,024 likopi
Cycle 30: Likopi tse fetang 1 bilione
Likarolo tsa mantlha tsa theknoloji ea PCR
Bokhabane ba theknoloji ea mochini oa PCR bo itšetlehile ka lisebelisoa tsa eona tsa ka hare, haholo-holo lisebelisoa tsa ho futhumatsa tsa Peltier, silevera kapa aluminium thermal block, le software e rarahaneng ea taolo e laolang liphetoho tse potlakileng tsa mocheso.
Karolo ea bohlokoa ka ho fetisisa ke Peltier element, e leng pompo ea mocheso e sebetsang ea boemo bo tiileng e fetisang mocheso ho tloha lehlakoreng le leng la sesebelisoa ho ea ho le leng khahlanong le mocheso oa mocheso. Sena se lumella ho futhumatsa le ho pholile ho tsoa mohloling o le mong, ho nolofalletsa mochine oa PCR ho fetola mocheso ka metsotsoana. Lebelo leo liphetoho tsena li etsahalang ka lona-tse tsejoang e le 'sekhahla sa marang-rang' -le khetholla ka ho toba katleho le ts'ebetso ea laboratori ka kakaretso. Hangata mechine e phahameng e na le li-blocks tsa silevera tse entsoeng ka khauta ho eketsa conductivity ea mocheso.
Li-sensor le microprocessors li theha 'boko' ba sesebelisoa. Likarolo tsena li lekola mocheso oa block ka nako ea nnete, ho lokisa matla ho likarolo tsa Peltier ho thibela mocheso o fetelletseng kapa o tlase. Sistimi ea sejoale-joale e sebelisa li-sensor tse ngata ho potoloha block ho netefatsa hore sampole e 'ngoe le e' ngoe e na le maemo a tšoanang a mocheso. Bakeng sa mehaho e batlang ho ntlafatsa hardware ea bona, ho khetha e ka tšeptjoang Mofani oa mochini oa PCR o netefatsa phihlello ea theknoloji ea morao-rao ea sensor le boenjiniere bo matla.
Sekoahelo se futhumetseng ke karolo e 'ngoe ea bohlokoa empa hangata e hlokomolohuoa. Ka ho boloka sekoahelo mochesong o phahame hanyane ho feta mocheso o phahameng oa block (hangata o pota-potileng likhato tse 105 tsa Celsius), mochine o thibela ho tsoa mouoane le ho kokobetsa ha motsoako oa karabelo holim'a li-tube caps. Sena se tiisa hore likhakanyo tsa li-reagents li lula li sa fetohe ho pholletsa le 30 ho ea ho 40 cycles, e leng ea bohlokoa bakeng sa tekanyo ea lik'hemik'hale ea karabelo.
Lintlha tsa bohlokoa tsa Hardware
Thermal Block: Ka tloaelo e tšoara liliba tse 96 kapa 384.
Ramp Rate: Lebelo la phetoho ea mocheso (e lekantsoe ka °C/s).
Ho nepahala: Mocheso oa block o haufi hakae le setpoint.
Uniformity: Thempereichara e tsitsitseng ho pholletsa le liliba tsohle.
Mefuta ea Mechini ea PCR le Tšebeliso ea eona
Biology ea sejoale-joale ea limolek'hule e sebelisa likarolo tse tharo tsa mantlha tsa theknoloji ea PCR: Gradient PCR bakeng sa ntlafatso, PCR ea Nako ea 'Nete (qPCR) bakeng sa lipalo, le Digital PCR bakeng sa ho nepahala ho felletseng ha ho fumanoa ka seoelo.
Li-Standard Thermal Cyclers ke mofuta o sebelisoang haholo lipatlisisong tsa mantlha le thutong. Mechini ena e etselitsoe 'end-point' PCR, ho bolelang hore liphetho li hlahlobjoa ka mor'a hore li-cycle li phethoe, hangata ka gel electrophoresis. Phapang ea sena ke Gradient PCR mochine , e lumellang mosebedisi ho beha mocheso o fapaneng ho pholletsa le thibela nakong ea ho matha ha 'ngoe. Sena se bohlokoa haholo bakeng sa ho fumana mocheso o nepahetseng bakeng sa li-primers tse ncha, ho boloka lihora tsa liteko le liphoso.
Mechini ea Nako ea 'Nete ea PCR (qPCR) e emela lebelo le leholo la theknoloji. Lisebelisoa tsena li kenyelletsa sistimi e kopaneng ea optical (lasers kapa li-LED le li-detectors) ho lekola fluorescence ea disampole tsa DNA nakong ea ts'ebetso ea amplification. Sena se lumella tlhahlobo ea 'quantitative', moo bafuputsi ba ka tsebang hantle hore na ke bokae ba tatellano e itseng ea DNA e neng e le teng sampoleng ea pele. Theknoloji ena ke tekanyetso ea khauta bakeng sa tlhahlobo ea bongata ba kokoana-hloko le lithuto tsa liphatsa tsa lefutso. Ho utloisisa theko le litlhaloso tsa likarolo tsa PCR li bohlokoa ha u etsa qeto pakeng tsa sebaesekele se tloaelehileng le sistimi e tsoetseng pele ea qPCR.
Digital PCR (dPCR) ke phetoho ea morao-rao, e fanang ka palo e felletseng ntle le tlhoko ea mothinya o tloaelehileng. Mohlala o arotsoe ka marotholi a manyane a likete, 'me karabelo ea PCR e etsahala ho e' ngoe le e 'ngoe. Ka ho bala palo ea marotholi a 'positive' khahlano le 'negative', mochini o fana ka palo e nepahetseng haholo ea limolek'hule tsa DNA. Sena se bohlokoa haholo bakeng sa ho bona liphetoho tse sa tloaelehang ho biopsies ea mokelikeli kapa lisampole tsa tikoloho moo sepheo sa DNA se leng teng maemong a tlase haholo.
Papiso ea PCR Technologies
| Sebopeho |
PCR e tloaelehileng |
PCR ea Nako ea 'Nete (qPCR) |
PCR ea Dijithale (dPCR) |
| Ho lemoha |
Qetello-ntlha |
Hona joale |
Qetello (Absolute) |
| Quantification |
Boleng ba boleng |
Leloko/Bongata |
Ruri |
| Kutloisiso |
E itekanetseng |
Phahameng |
Haholo-holo |
| Ho rarahana |
Tlase |
E itekanetseng |
Phahameng |
Bohlokoa ba ho Kopana ha Thermal
Ho lumellana ha mocheso ho bolela ho lumellana ha mocheso ho pholletsa le liliba tsohle tsa PCR block, ntlha ea bohlokoa e tiisang hore sampole e 'ngoe le e 'ngoe ka poleiti ea seliba sa 96 e holisa ka lebelo le ts'oanang mme e hlahisa litholoana tse ka ikatisang.
Haeba k'honeng e le 'ngoe ea 'thermal block' e bata ho feta bohareng, DNA e ka lilibeng tseo e kanna ea se ke ea fetoha ka ho felletseng, kapa li-primers li ka tlama eseng ka ho khetheha. Sena se lebisa ho 'phapang ea hantle ho ea hantle,' e ka senyang teko eohle kapa, ho hobe le ho feta, ea lebisa ho phoso e fosahetseng sebakeng sa tlhahlobo ea bongaka. Baetsi ba modeli ea oa boleng bo holimo mochini oa PCR ba tsetela haholo mochining o nepahetseng le ho futhumatsa libaka tse ngata ho fokotsa likotsi tsena le ho fana ka ho tšoana ho tloha pheletsong ho isa pheletsong.
Lisebelisoa tse tsoetseng pele tsa software li sebelisetsoa ho lefella 'phello ea moeli,' moo liliba tse moeling oa boloko li lahleheloang ke mocheso ka potlako ho feta tse bohareng. Ka ho laola libaka tse fapaneng tsa Peltier ka boikemelo, mochini o ka pompa mocheso o mongata ho ea mathōkong ho boloka boemo bo bataletseng ba mocheso. Ha u etsa lipatlisiso ka thepa, ho molemo ho sheba a lethathamo la mochini oa boleng bo holimo oa PCR ho bapisa hore na mefuta e fapaneng e sebetsana joang le taolo ea mocheso le ho thibela ho lekanya.
Reproducibility ke motheo oa saense. Hore na tlhahlobo e etsoa London kapa Shanghai, mochini oa PCR o tlameha ho fana ka ts'ebetso e ts'oanang ea mocheso. Ke ka lebaka leo litekanyetso tsa machaba le ho lekoa khafetsa li tlamang bakeng sa lilaboratori tsa kliniki. Mochini o sa ts'oaneng hantle o tla hlahisa 'Ct' (mokoloko oa potoloho) boleng bo sa tsitsang ho qPCR, e leng ho etsang hore ho se khonehe ho lekanya ka nepo bongata ba kokoana-hloko kapa matšoao a liphatsa tsa lefutso ho pholletsa le matha kapa lilaboratori tse fapaneng.
Lintlha tse Amang ho Tšoanang
Block Material: Silevera e phahametse aluminium bakeng sa kabo ea mocheso.
Boleng ba Peltier: Li-Peltier tsa boemo bo holimo li fana ka nako e telele ea bophelo le ho futhumatsa ho tsitsitseng.
Sebaka sa Sensor: Li-sensor tse ngata li fana ka maikutlo a betere bakeng sa loop ea taolo.
Likopo ho Litlhahlobo tsa Kajeno
Ts'ebeliso ea mahlale a PCR a akaretsa boitsebahatso ba mafu a tšoaetsanoang, oncology bakeng sa ho lemoha matšoao a mofetše, le mahlale a forensic, moo e sebelisetsoang ho theha lintlha tsa DNA ho tsoa lisampoleng tsa bioloji.
Sebakeng sa mafu a tšoaetsanoang, mochini oa PCR o fetohile sesebelisoa sa bohlokoahali. E lumella ho lemoha likokoana-hloko tse kang HIV, Hepatitis, le likokoana-hloko tsa phefumoloho tse nang le kutlo e phahameng haholo le lebelo ho feta mekhoa ea setso sa setso. Hobane mochine o khona ho lemoha boteng ba lefutso la kokoana-hloko ka ho toba, o ka tseba tšoaetso nako e telele pele mokuli a e-ba le karabelo ea 'mele ea ho itšireletsa mafung kapa matšoao, e leng se lumellang ho kenella pele ho nako le ho laola bophelo bo botle ba sechaba.
Oncology ke tšimo e 'ngoe e ruang molemo haholo theknoloji ena. PCR e sebelisetsoa ho bona liphetoho tse itseng tsa lefutso tse amanang le mefuta e itseng ea mofetše. Sena se lumella 'meriana ea motho ka mong,' moo lingaka li ka khethang phekolo e sebetsang ka ho fetisisa ho latela liphatsa tsa lefutso tsa hlahala. Bakeng sa ba batlang ho tseba ka karolo ea theknoloji ho tsa bophelo bo botle, bala ka litšenyehelo le ts'ebeliso ea lits'ebetso tsa PCR li fana ka temohisiso ea hore na lipetlele li leka-lekanya theknoloji ea maemo a holimo joang le lichelete tsa ts'ebetso.
Saense ea forensic e itšetleha ka PCR ho holisa DNA ho tsoa litsing tsa botlokotsebe, joalo ka moriri o le mong kapa lerotholi la mali. Ka ho lebisa tlhokomelo libakeng tse itseng tsa genome ea motho e fapaneng pakeng tsa batho ka bomong (STRs), litsebi tsa litsebi tsa litsebi li ka etsa DNA e ikhethang ea menoana. Theknoloji ena e fetotse tsamaiso ea molao, e fana ka bopaki bo matla bakeng sa likahlolo le ho hlakoloa ha ba qosoang ka phoso.
Makala a Maholo a Kopo
Tlhahlobo ea Meriana: Tlhahlobo ea likokoana-hloko le tlhahlobo ea bokhachane.
Tšireletseho ea Lijo: Ho lemoha li-GMO kapa likokoana-hloko tse jeoang ke lijo tse kang Salmonella.
Environmental Science: Ho beha leihlo palo ea likokoana-hloko mobung kapa metsing.
Patlisiso: Cloning, tatellano, le tlhahlobo ea polelo ea liphatsa tsa lefutso.
Malebela a Tlhokomelo le Ntlafatso
Ho netefatsa bophelo bo bolelele le ho nepahala ha mochini oa PCR, lilaboratori li tlameha ho kenya tšebetsong liprothokholo tse thata tsa tlhokomelo, ho kenyeletsoa tlhoekiso ea kamehla ea li-block, calibration ea sekoaelo, le netefatso ea mocheso oa setsebi.
Tšoaetso ke sera se seholo sa PCR. Esita le molek'hule e le 'ngoe ea DNA ho tloha nakong e fetileng e ka matlafatsoa, e lebisang ho liphello tse fosahetseng. Ka hona, block block ea mochini oa PCR e lokela ho hloekisoa khafetsa ka litharollo tse khethehileng tsa ho tlosa DNA kapa 10% bleach e lateloang ke ethanol. Ho bohlokoa hape ho netefatsa hore li-tubes li tiisitsoe ka nepo ho thibela ho tsoa ha sampole ka lilibeng, ho ka senyang bokaholimo ba boloko le ho sitisa phetiso ea mocheso.
Tekanyetso ea kamehla le eona ke ea bohlokoa. Ha nako e ntse e ea, likarolo tsa Peltier li ka 'na tsa senyeha, tsa lebisa ho lebelo le fokolang kapa ho fokotseha ha mocheso oa mocheso. Litšebeletso tsa profeshenale tsa ho lekanya li sebelisa mokhoa oa 'multiprobe' ho lekanya mocheso oa liliba tse 'maloa ka nako e le' ngoe nakong ea ho soma. Sena se tiisa hore mochini o ntse o sebetsa ka har'a mamello e boletsoeng ke moetsi. Bakeng sa li-laboratory tse batlang lisebelisoa tse matla tse nang le lintlha tse bonolo tsa tlhokomelo, ho buisana le setsebi se khethehileng Mofani oa lisebelisoa tsa PCR a ka thusa ho khetha mefuta e etselitsoeng tšebeliso e boima.
Lintlafatso tsa software ha lia lokela ho hlokomolohuoa. Hangata bahlahisi ba lokolla lintlafatso tsa firmware tse ntlafatsang li-algorithms tsa taolo ea mocheso kapa ho eketsa likarolo tse ncha ho sebopeho sa mosebelisi. Ho boloka software ea mochini e ntse e le teng ho netefatsa hore o rua molemo ho tsoa ho lintlafatso tsa morao-rao tsa taolo ea mocheso. Ho phaella moo, kamehla sebelisa lisebelisoa tsa boleng bo phahameng ba PCR (li-tubes le lipoleiti), kaha li-plastiki tse nang le marako a tšesaane li etselitsoe ho thusa ho fetisa mocheso ka potlako ho tloha ho thibela ho ea motsoako oa karabelo.
Lethathamo la Tlhokomelo
Letsatsi le letsatsi: Hlakola bokantle 'me u hlahlobe sekoahelo se futhumetseng.
Beke le Beke: Hlahloba liliba bakeng sa maloanlahla kapa ho lutla; hloekisa boloko.
Kgwedi le Kgwedi: Etsa tlhahlobo ya ho itlhahloba haeba e fumaneha ho software.
Selemo le selemo: Ho netefatsa le ho lekanya mocheso oa setsebi.
Qetello
Theknoloji ea mochini oa PCR ke setsebi sa boenjiniere bo nepahetseng le k'hemistri ea limolek'hule. Ka ho fana ka tikoloho e laoloang bakeng sa ho holisa DNA, lisebelisoa tsena li notlollotse makunutu a liphatsa tsa lefutso le ho fana ka lisebelisoa tse hlokahalang ho loantša mafu a seoa a lefats'e, ho phekola mofetše le ho rarolla litlolo tsa molao. Ha re ntse re leba lits'ebetsong tse kopaneng le tsa dijithale, melaoana ea mantlha ea ho palama libaesekele e ntse e sebetsa joalo ka mehleng.
Bakeng sa lilaboratori le litsi tsa bongaka, ho khetha thekenoloji e nepahetseng ea PCR ke tekanyo ea lebelo, ho nepahala le ho boloka litšenyehelo. Ebang ke sebaesekele sa motheo sa mocheso bakeng sa merero ea thuto kapa sistimi e tsoetseng pele ea nako ea nnete bakeng sa tlhahlobo e hlokolosi, ho utloisisa metjhini e ka morao ho mochini ke mohato oa pele oa ho fihlela liphetho tse tšepahalang le tse nang le tšusumetso. Bokamoso ba theknoloji ea PCR e tšepisa liphetho tse potlakileng le ho feta, ho nkeha habonolo, le kutloisiso e phahameng, ho tsoela pele ka karolo ea eona e le motheo oa tsoelopele ea mahlale.
