ʻO ka Polymerase Chain Reaction, i ʻike nui ʻia ʻo PCR, ke hōʻike nei i kekahi o nā holomua ʻenehana koʻikoʻi i ka mōʻaukala o ka biology molecular. Hoʻokumu ʻia i ka makahiki 1980, ua hoʻololi ʻia kēia ʻenehana mai kahi kaʻina hana hoʻokolohua kūikawā i kahi mea hana pono i hoʻohana ʻia i nā diagnostics medical, forensic science, a me ka noiʻi genetic. Ma ka ʻae ʻana i ka poʻe ʻepekema e lawe i kahi laʻana liʻiliʻi o DNA a hoʻonui iā ia i miliona o nā kope, ua hiki i ka PCR ke aʻo i nā ʻano kikoʻī, ʻike i nā pathogens me ka pololei loa, a ʻike i nā hōʻailona genetic i ʻike ʻole ʻia i nā ʻano analytical maʻamau.
ʻO ke kaʻina hana PCR he hana ʻenehana i hoʻohana ʻia no ka hana ʻana i nā kope he nui o kahi ʻāpana DNA kikoʻī ma o ke kaʻina o nā hoʻololi wela, e pili ana i ka denaturation, annealing, a me ka hoʻonui ʻia, i hoʻomaʻamaʻa ʻia e kahi mīkini PCR kūikawā a me ka polymerase DNA paʻa wela.
ʻO ka hoʻomaopopo ʻana i ka paʻakikī o ke kaʻina PCR he mea nui ia no ka poʻe loea lab, nā mea noiʻi lapaʻau, a me nā mea hana ʻenehana i komo i nā lako diagnostic. Ke hoʻomau nei ka noi no ka hoʻāʻo molecular wikiwiki a pololei i ka honua, ʻo ka hilinaʻi o ka Lilo ka mīkini PCR i pōhaku kihi o nā hopena hoʻokolohua kūleʻa. Hāʻawi kēia ʻatikala i kahi alakaʻi piha i nā ʻanuʻu, nā mahana, a me nā koi mechanical o ke kaʻina PCR e hōʻoia i ka hoʻonui ʻana i ka DNA kiʻekiʻe a me nā hopena hoʻokolohua ikaika.
Papa Hōʻuluʻulu ʻatikala
| Māhele |
Hōʻuluʻulu manaʻo |
| He aha ka PCR? |
ʻO ka PCR kahi ʻenehana biology molecular i hoʻohana ʻia e hoʻonui nui i nā kaʻina DNA kikoʻī no nā noi like ʻole. |
| He aha ka mea e pono ai no ka PCR? |
Pono ka PCR kūleʻa i DNA maʻamau, nā kumu mua, nā nucleotides, ka DNA polymerase paʻa, a me kahi kaʻa kaʻa wela kiʻekiʻe. |
| He aha nā ʻanuʻu 4 o PCR? |
Hoʻopili ke kaʻina hana i kahi kaʻina kūpono o ka hoʻomaka, denaturation, annealing, a me ka hoʻonui ʻana e pālua i ka ʻike DNA i kēlā me kēia pōʻai. |
| He aha nā ʻanuʻu mīkini PCR? |
Hoʻomaʻamaʻa nā mea hana i nā hoʻololi wela kūpono, e hōʻoiaʻiʻo ana i nā hopena biochemical i nā manawa kūpono. |
| He aha ka mahana i hoʻohana ʻia no ka pae denature? |
Hoʻohana ʻia nā mahana kiʻekiʻe, maʻamau ma waena o 94 ° C a me 98 ° C, e uhaki i nā paʻa hydrogen a hoʻokaʻawale i ka DNA stranded pālua. |
| He aha ka hana i ka wā o ka annealing? |
I loko o kēia māhele, hoʻohaʻahaʻa ʻia ka mahana e hiki ai i nā primers ke hoʻopaʻa kikoʻī i kā lākou mau kaʻina pahuhopu hoʻohui i ka DNA stranded hoʻokahi. |
| He aha ka mahana i hoʻohana ʻia no ka pae hoʻonui? |
Hana ʻia kēia ʻanuʻu ma 72°C, ʻo ka mahana maikaʻi loa no Taq polymerase e synthesize i kahi kaula DNA hou. |
| He aha ke kahe wela o ka PCR? |
Hoʻokomo ʻia ke kahe i ke ʻano kaʻa kaʻa wikiwiki o nā wela kiʻekiʻe, haʻahaʻa, a me ka haʻahaʻa e hana hou a hiki i ka ʻike i makemake ʻia. |
He aha ka PCR?
ʻO ka PCR, a i ʻole Polymerase Chain Reaction, he ʻano hana biology molecular transformative i hoʻolālā ʻia e hana wikiwiki i nā miliona a i nā piliona kope o kahi laʻana DNA kikoʻī.
Ma kāna kumu, hana ʻo PCR ma ke ʻano he 'kope paʻi kiʻi biological.' Ma mua o ka hana ʻana, ʻo ka hoʻonui ʻana i ka DNA he hana lohi a paʻakikī e pili ana i ka hoʻopili ʻana i ka DNA i loko o ka bacteria. Me ka hiki ana mai o ka Mīkini PCR , hiki i nā mea noiʻi ke hoʻokaʻawale i kahi ʻano kikoʻī a i ʻole ʻāpana o ka genome a hoʻonui iā ia i loko o nā hola. He mea koʻikoʻi kēia mana no ka mea ʻo ka hapa nui o nā loiloi biochemical e koi i ka nui o ka DNA e hāʻawi i kahi hōʻailona hiki ke ʻike ʻia, a ʻo nā laʻana kūlohelohe e hāʻawi pinepine i nā huina.
Hōʻike ʻia ka versatility o kēia ʻenehana i kāna ʻano hana like ʻole ma nā ʻoihana like ʻole. I nā hoʻonohonoho hoʻokolohua, hoʻohana ʻia ia e ʻike i nā ukana viral, e like me ka COVID-19 a i ʻole ka hoʻāʻo HIV. Ma ka forensics, hiki i nā mea noiʻi ke ʻike i nā kānaka mai nā laʻana microscopic o nā mea olaola. I ka ʻoihana ʻoihana, hōʻoia ʻo PCR i ka maʻemaʻe o nā huahana meaʻai a me ka ʻike ʻana i nā meaola i hoʻololi ʻia. Ka hoomaopopo ana i ka ʻO nā loina a me nā kumukūʻai o ka ʻenehana PCR he mea koʻikoʻi ia no nā labs e nānā ana e hoʻomaikaʻi i kā lākou hiki ke diagnostic.
He aha nā mea e pono ai no ka PCR?
Pono ka hopena PCR holomua elima mau mea nui: ka DNA template, specific primers, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), he DNA polymerase heat-stable (e like me Taq), a me ka solution buffer specialized.
Hoʻohana ʻia ke ʻano hoʻohālike DNA ma ke ʻano o ka hoʻolālā kumu āu e makemake ai e kope. ʻO nā kumu mua he mau ʻāpana synthetic o DNA i hana maʻamau e hoʻohālikelike i ka hoʻomaka a me ka hopena o ke kaʻina pahuhopu. Inā ʻaʻole kēia mau mea, ʻaʻole ʻike ka DNA polymerase i kahi e hoʻomaka ai e kūkulu i ke kaula hou. ʻO nā dNTP (A, T, C, a me G) nā poloka kūkulu maka i hoʻohana ʻia e ka enzyme e kūkulu i ke kaulahao DNA hou.
ʻO ke koʻikoʻi like ke kaiapuni kahi e hana ai ka hopena. Hāʻawi ka buffer i kahi kaiaola kemika paʻa, ʻoi aku ka nānā ʻana i ka pH a me ka neʻe ʻana o nā ion magnesium, ʻo ia nā cofactors pono no ka DNA polymerase enzyme. ʻO ka mea hope loa, ʻo ka hoʻokō kino ʻana o ka hopena e koi ai i kahi mea hoʻokele wai wela kiʻekiʻe, i ʻōlelo pinepine ʻia he mīkini PCR , nāna e hoʻomalu pono i nā loli wikiwiki e pono ai e hoʻomaka i kēlā me kēia pae o ka hopena.
ʻO nā mea nui o ka PCR Mix
DNA template : ʻO ka laʻana i loaʻa ke kaʻina pahuhopu.
DNA Polymerase : ʻO Taq polymerase maʻamau, e hoʻomau mau ana i nā wela kiʻekiʻe.
Nā mea mua : Nā kaula i mua a i hope e wehewehe i nā palena hoʻonui.
dNTPs : ʻO nā kumu nucleotide ʻehā e lawelawe ana ma ke ʻano he 'ink' no ka mea kope kope.
Buffer a me nā Ion : Mālama i ka pono enzymatic a me ka paʻa.
He aha nā ʻanuʻu 4 o PCR?
Aia i loko o ke kaʻina hana PCR ʻehā mau pae hana mua: Initialization, Denaturation, Annealing, and Extension (ʻike ʻia ʻo Elongation).
ʻO ka pae mua, ʻo Initialization, he hanana hoʻokahi manawa kahi e hoʻomehana ʻia ai ke keʻena pane i kahi wela kiʻekiʻe e hōʻoia i ka hoʻōla piha ʻana o ka DNA polymerase a hoʻopau ʻia nā mea haumia. Ma hope o kēia, hoʻomaka ka pōʻai o Denaturation, kahi i hoʻokaʻawale ʻia ai ka DNA stranded pālua. Hoʻopili ʻia kēia e Annealing, kahi e ʻike ai nā mea mua i kā lākou mau pahuhopu, a ma hope o Extension, kahi i hana ʻia ai ka DNA hou. Hoʻopili hou ʻia kēia pōʻai ʻekolu (Denaturation, Annealing, Extension) 25 a 40 mau manawa.
Ma muli o ka pālua ʻana o ka DNA me kēlā me kēia pōʻai holomua, ʻoi aku ka nui o ka ulu. No ka laʻana, ma hope o 30 pōʻai, hiki ke hoʻololi ʻia kahi mole o DNA i ʻoi aku ma mua o hoʻokahi piliona kope. ʻO kēia kūpono ka mea e hana ai . Inā ʻaʻole i loaʻa i ka mea nui no ka ʻepekema hou o kēia wā kiʻekiʻe ka wikiwiki o ka hoʻomehana a me ka hoʻomaha ʻana mīkini PCR , e lohi loa ke kaʻina hana no ka hoʻohana pono ʻana i nā kaiapuni diagnostics high-throughput.
He aha nā ʻanuʻu mīkini PCR?
ʻO nā ʻanuʻu mīkini PCR e pili ana i ke kaʻa uila o nā wela ma o ka mana uila pololei o kahi poloka wela, ka hoʻokele ʻana i ka ramp rate, ka manawa paʻa, a me ka hoʻomaha ʻana.
Hoʻohana ka mīkini PCR me ka hoʻohana ʻana i nā mea Peltier e hoʻomehana wikiwiki a hoʻoluʻu i kahi poloka metala e paʻa ai nā paipu hopena. ʻO nā 'ʻanuʻu ' mai ka ʻike o ka mīkini e komo i ka 'Ramp,' ʻo ia ka wikiwiki o ka hoʻololi ma waena o nā mahana, a me ka 'Hold,' ʻo ia ka lōʻihi e mālama ai ka mīkini i kahi wela kikoʻī. Hoʻolālā ʻia nā mīkini kiʻekiʻe e loaʻa ka wikiwiki o ka ramp rate e hōʻemi i ka manawa i hoʻololi ʻia, e hōʻemi ana i ka pilikia o ka paʻa ʻole kikoʻī a i ʻole ka hoʻohaʻahaʻa ʻana i ka enzyme.
ʻO ka polokalamu i loko o ka mīkini hiki i nā mea hoʻohana ke hoʻolālā i nā protocol paʻakikī. Hoʻopili kēia i ka wela mua, nā puka lou hou o nā ʻanuʻu nui ʻekolu, a me kahi ʻanuʻu paʻa hope ma kahi mahana anuanu (maʻamau 4°C) e mālama i nā laʻana a hiki i ka ʻenehana ke kiʻi hou iā lākou. ʻAe ʻia nā loulou kikohoʻe hou ma ka mīkini PCR no ka nānā ʻana i ka manawa maoli o ka hopena, me ka hōʻoia ʻana e hahai ʻia ka ʻaoʻao wela e like me ka papahana no ka hiki ke hana hou.
He aha ka mahana i hoʻohana ʻia no ka pae denature?
Hoʻohana maʻamau ka hana denaturation i nā mahana ma waena o 94°C a me 98°C e hoʻomaʻamaʻa i ka haki ʻana o nā paʻa hydrogen ma waena o nā kaula DNA.
I kēia wela nui, ua paʻa ʻole ke ʻano helix pālua o ka DNA. Hoʻoheheʻe ʻia nā paʻa hydrogen e paʻa ana i ka adenine-thymine a me ka cytosine-guanine paʻa, e hopena i ʻelua mau kaula kūʻokoʻa o DNA. He koʻikoʻi koʻikoʻi kēia no nā ʻanuʻu aʻe, no ka mea, hiki i nā primers a me ka DNA polymerase enzyme ke launa pū me nā maʻi maʻi hoʻokahi. Inā haʻahaʻa loa ka mahana, ʻaʻole e kaʻawale loa ka DNA, e alakaʻi ana i ka hoʻonui ʻana a i ʻole ka maikaʻi ʻole.
Eia nō naʻe, ʻo ka mālama ʻana i kēia mahana e pono ai kahi DNA polymerase ikaika loa. ʻO ia ke kumu o ka loaʻa ʻana o Taq polymerase, i hoʻokaʻawale ʻia mai ka huakino aloha wela ʻo Thermus aquaticus . E hoʻopau ʻia nā enzyme maʻamau ma 95 ° C, akā mau nō ʻo Taq. Pono nā Laboratories e hōʻoia i kā lākou mīkini PCR e hāʻawi i ka hoʻomehana like ʻana ma nā pūnāwai a pau e pale ai i nā 'ʻokoʻa anu' kahi e pau ai ka denaturation, kahi hiʻohiʻona nui o kiʻekiʻe kiʻekiʻe molecular biology lako.
He aha ka mea e hana ai i ka wā e hoʻopili ai i ka PCR?
I ka wā o ka hoʻopili ʻana, hoʻohaʻahaʻa ʻia ka mahana ma waena o 50 ° C a me 65 ° C, e ʻae ana i nā kumu mua o ka DNA e hoʻopaʻa i kā lākou mau kaʻina hoʻohui ma nā ʻano hoʻohālike DNA i hoʻopaʻa ʻia.
ʻO kēia ʻanuʻu paha ka ʻāpana koʻikoʻi o ke kaʻina PCR. ʻO ka wela kikoʻī i hoʻohana ʻia ma muli o ka wela hoʻoheheʻe ʻana (Tm) o nā kumu mua i hoʻohana ʻia. Inā kiʻekiʻe loa ka mahana, ʻaʻole e hoʻopaʻa nā primers i ka template. Inā haʻahaʻa loa, hiki i nā mea hoʻomaka ke hoʻopaʻa i nā kaʻina e like wale ana ka ''āpana', e alakaʻi ana i ka hoʻonui ʻole a me nā hopena ʻino. Pono e hiki i ka mīkini PCR ke paʻi i kēia wela wela me ke kiʻekiʻe o ka pololei (pinepine i loko o 0.1°C).
ʻO ka lōʻihi o ka hana hoʻopulapula maʻamau he 20 a 40 kekona. I loko o kēia pukaaniani pōkole, hoʻokele nā primers i ka hui ʻana ma o ka neʻe ʻana o ka molekala a paʻi i ka pae i ʻimi ʻia. Ke hoʻopili ʻia nā primers, hāʻawi lākou i kahi hoʻomaka no ka DNA polymerase e hoʻomaka ai e hoʻohui i nā nucleotides. ʻO kēia hoʻonohonoho pololei ka mea e hiki ai ke ʻike i nā mutation genetic kikoʻī a i ʻole nā pathogens i loko o kahi laʻana olaola paʻakikī, e hana ana i ka ʻO ka hoʻopukapuka ʻana i nā mīkini diagnostic ʻoihana kahi mea nui no nā lab lapaʻau.
He aha ka mahana i hoʻohana ʻia no ka pae hoʻonui?
Hana ʻia ka ʻanuʻu hoʻonui ma 72 ° C, ʻo ia ka mahana hana maikaʻi loa no ka polymerase DNA paʻa wela e synthesize i ke kaula DNA hou.
Ma 72 ° C, aia ka DNA polymerase enzyme i kona kiʻekiʻe kiʻekiʻe. Hoʻomaka ia ma ka pae mua a hoʻomaka e hoʻohui i nā dNTP i ka hopena 3' o ka primer, e neʻe ana ma ke kaula template. ʻO ka enzyme 'heluhelu' i ka mamana a kau i ke kumu hoʻohui i ke kaula hou. No ka laʻana, inā he Adenine ka laʻana, hoʻohui ka polymerase i Thymine. ʻO ka wikiwiki o kēia hopena he mea kupaianaha; Hiki i ka Taq polymerase ke hoʻohui ma kahi o 1,000 base pairs i kēlā me kēia minuke.
ʻO ka lōʻihi o ka manawa no kēia kaʻina e pili ana i ka lōʻihi o ka māhele DNA i kope ʻia. Inā he 1,000 ka lōʻihi o ke kaʻina i hoʻopaʻa ʻia, hiki ke hoʻonohonoho ʻia ka pae hoʻonui no hoʻokahi minuke. Inā ʻoi aku ka pōkole o ka pahuhopu, hiki ke hoʻemi ʻia ka manawa e mālama i ka manawa hana holoʻokoʻa. ʻO ka hoʻopaʻa ʻana i ka mīkini PCR i ka 72 ° C i loko o kēia māhele he mea nui ia no ka hoʻopau ʻana i nā kaula DNA piha.
He aha ke kahe wela o ka PCR?
ʻO ke kahe wela o ka PCR e hahai ana i ka pōʻai hou o ka denaturation wela kiʻekiʻe, ka hoʻopili ʻana i ka wela haʻahaʻa, a me ka hoʻonui ʻana i ka wela, e hana ana i kahi ʻaoʻao wela 'sawtooth'.
Hoʻolālā ʻia kēia kahe e hoʻonui i ka holomua geometric o ka nui DNA. Ma kahi holo maʻamau, hoʻomaka ka mīkini ma 95 ° C no 2 mau minuke (Initial Denaturation), a laila komo i kahi loop: 95 ° C no 30 kekona, 55 ° C no 30 kekona, a me 72 ° C no 60 kekona. Hoʻopili hou kēia loop 30 manawa. ʻO ka hope, aia kahi 'Final Extension' ma 72°C no 5-10 mau minuke e hōʻoia i ka pau ʻana o ka DNA stranded a pau i kau pālua ma mua o ka maʻalili ʻana o ka mīkini i 4°C no ka mālama ʻana.
Hoʻopili pololei ka pololei o kēia kahe wela i ka hua a me ka maʻemaʻe o ka huahana PCR. Inā ʻaʻole kūlike ke kahe, hiki i ka enzyme ke nalowale i ka hana a i ʻole nā mea hoʻomaka e hana i nā 'primer dimer', ʻo ia nā mea waiwai ʻole o ka hopena. Ma muli o kēia, ʻo ka calibration a me ka thermal uniformity o ka mīkini PCR ka mea koʻikoʻi loa no kēlā me kēia keʻena e hana ana i nā diagnostics molecular a i ʻole ka noiʻi.
Papa Hōʻuluʻulu o ke kahe wela
| Māhele |
Mahana maʻamau |
Ke kumu |
| Hoʻomaka |
94°C – 96°C |
Hoʻoulu i ka enzyme, hoʻopau i ka DNA paʻakikī. |
| Denaturation |
94°C – 98°C |
Hoʻokaʻawale i ka DNA kaulua i nā kaula hoʻokahi. |
| Hoʻopili |
50°C – 65°C |
Hāʻawi i nā primers e hoʻopaʻa i nā kaʻina pahuhopu. |
| Hoʻonui |
72°C |
Hoʻopili ka DNA polymerase i nā kaula DNA hou. |
| Paʻa hope |
4°C – 10°C |
Hoʻopaʻa manawa pōkole o ka huahana i hoʻonui ʻia. |
Ka hopena
ʻO ka Polymerase Chain Reaction he mea hana nani a ikaika hoʻi i hoʻololi i ka ʻāina o ka ʻepekema olaola. Ma ka hahai ʻana i nā ʻanuʻu koʻikoʻi o ka denaturation, annealing, a me ka hoʻonui ʻana, hiki i nā ʻepekema ke wehe i nā mea huna i mālama ʻia i loko o DNA, e hāʻawi ana i nā pane i nā nīnau lapaʻau a me nā forensic paʻakikī. ʻO ka holomua o kēia kaʻina hana e hilinaʻi nui ʻia i ka maikaʻi o nā reagents a me ka pololei o ka mīkini PCR i hoʻohana ʻia e hoʻokō i nā pōʻai wela.
No kēlā me kēia keʻena hana e ʻimi ana e hoʻokō i nā hopena kūpaʻa a hilinaʻi, pono ka hoʻomaopopo ʻana i nā nuances o ka mālama ʻana i ka mahana a me ka hoʻokele pōʻaiapuni. Inā ʻoe e alakaʻi nei i ka noiʻi kumu a i ʻole ka nui o nā diagnostics clinical, ʻo ke koho ʻana i nā mea hana a me ka pili ʻana i nā protocols i hoʻopaʻa ʻia e wehewehe i ka pololei o kāu hana. No ka poʻe hoihoi i ka ʻaoʻao logistic o ka hoʻonohonoho ʻana i kahi keʻena molecular, e ʻimi i ka ʻO nā kumukūʻai a me nā kikoʻī ʻenehana o nā ʻōnaehana PCR hou ka hana kūpono e hiki mai ana i ka holomua ʻana i kāu hiki ke diagnostic.
