Polymerase Chain Reaction (PCR) ຂັ້ນຕອນຂະບວນການ

ປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ Polymerase, ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນນາມ PCR, ເປັນຕົວແທນຫນຶ່ງຂອງຄວາມກ້າວຫນ້າທາງດ້ານເຕັກໂນໂລຢີທີ່ສໍາຄັນໃນປະຫວັດສາດຂອງຊີວະສາດໂມເລກຸນ. ການພັດທະນາໃນຊຸມປີ 1980, ເຕັກນິກນີ້ໄດ້ຫັນປ່ຽນຈາກຂັ້ນຕອນຫ້ອງທົດລອງພິເສດໄປສູ່ເຄື່ອງມືພື້ນຖານທີ່ໃຊ້ໃນການວິນິດໄສທາງການແພດ, ວິທະຍາສາດດ້ານນິຕິສາດ, ແລະການຄົ້ນຄວ້າພັນທຸກໍາ. ໂດຍການອະນຸຍາດໃຫ້ນັກວິທະຍາສາດເອົາຕົວຢ່າງນ້ອຍໆຂອງ DNA ແລະຂະຫຍາຍອອກເປັນລ້ານໆສໍາເນົາ, PCR ໄດ້ເຮັດໃຫ້ມັນເປັນໄປໄດ້ທີ່ຈະສຶກສາພັນທຸກໍາຢ່າງລະອຽດ, ກວດພົບເຊື້ອພະຍາດທີ່ມີຄວາມແມ່ນຍໍາທີ່ສຸດ, ແລະກໍານົດເຄື່ອງຫມາຍພັນທຸກໍາທີ່ເບິ່ງບໍ່ເຫັນໃນວິທີການວິເຄາະມາດຕະຖານ.

ຂະບວນການ PCR ເປັນເຕັກນິກຫ້ອງທົດລອງທີ່ໃຊ້ເພື່ອເຮັດໃຫ້ສໍາເນົາຫຼາຍສ່ວນຂອງ DNA ສະເພາະໂດຍຜ່ານວົງຈອນຂອງການປ່ຽນແປງຂອງອຸນຫະພູມ, ກ່ຽວຂ້ອງກັບການ denaturation, annealing, ແລະການຂະຫຍາຍ, ອໍານວຍຄວາມສະດວກໂດຍເຄື່ອງ PCR ພິເສດແລະ DNA polymerase ທົນທານຕໍ່ຄວາມຮ້ອນ.

ການເຂົ້າໃຈຄວາມຊັບຊ້ອນຂອງຂະບວນການ PCR ເປັນສິ່ງຈໍາເປັນສໍາລັບຜູ້ຊ່ຽວຊານຫ້ອງທົດລອງ, ນັກຄົ້ນຄວ້າທາງການແພດ, ແລະຜູ້ຜະລິດອຸດສາຫະກໍາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບອຸປະກອນການວິນິດໄສ. ໃນຂະນະທີ່ຄວາມຕ້ອງການສໍາລັບການທົດສອບໂມເລກຸນໄວແລະຖືກຕ້ອງຍັງສືບຕໍ່ຂະຫຍາຍຕົວໃນທົ່ວໂລກ, ຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖືຂອງ ເຄື່ອງ PCR ກາຍເປັນພື້ນຖານຂອງຜົນໄດ້ຮັບໃນຫ້ອງທົດລອງທີ່ປະສົບຜົນສໍາເລັດ. ບົດຄວາມນີ້ໃຫ້ຄໍາແນະນໍາທີ່ສົມບູນແບບກ່ຽວກັບຂັ້ນຕອນ, ອຸນຫະພູມ, ແລະຄວາມຕ້ອງການກົນຈັກຂອງຂະບວນການ PCR ເພື່ອຮັບປະກັນການຂະຫຍາຍ DNA ທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງແລະຜົນໄດ້ຮັບການທົດລອງທີ່ເຂັ້ມແຂງ.

ຕາຕະລາງສະຫຼຸບບົດຄວາມ

ພາກ	ສະຫຼຸບ
PCR ແມ່ນຫຍັງ?	PCR ແມ່ນເຕັກນິກຊີວະວິທະຍາໂມເລກຸນທີ່ໃຊ້ໃນການຂະຫຍາຍ ລຳ ດັບ DNA ສະເພາະ ສຳ ລັບແອັບພລິເຄຊັນລຸ່ມຕ່າງໆ.
PCR ຕ້ອງການຫຍັງ?	PCR ທີ່ປະສົບຜົນສໍາເລັດຕ້ອງການແມ່ແບບ DNA, primers, nucleotides, DNA polymerase ທີ່ຫມັ້ນຄົງ, ແລະເຄື່ອງວົງຈອນຄວາມຮ້ອນທີ່ມີຄວາມແມ່ນຍໍາສູງ.
PCR 4 ຂັ້ນຕອນແມ່ນຫຍັງ?	ຂະບວນການດັ່ງກ່າວປະຕິບັດຕາມລໍາດັບເຫດຜົນຂອງການເລີ່ມຕົ້ນ, denaturation, annealing, ແລະການຂະຫຍາຍເພື່ອ double ເນື້ອໃນ DNA ໃນແຕ່ລະຮອບວຽນ.
ຂັ້ນຕອນເຄື່ອງຈັກ PCR ແມ່ນຫຍັງ?	ອຸປະກອນອັດຕະໂນມັດການປ່ຽນແປງອຸນຫະພູມທີ່ຊັດເຈນ, ຮັບປະກັນປະຕິກິລິຍາທາງຊີວະເຄມີເກີດຂື້ນໃນໄລຍະເວລາທີ່ຕ້ອງການ.
ອຸນຫະພູມທີ່ໃຊ້ສໍາລັບຂັ້ນຕອນ denature ແມ່ນຫຍັງ?	ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ສູງ​, ໂດຍ​ປົກ​ກະ​ຕິ​ລະ​ຫວ່າງ 94 ° C ແລະ 98 ° C​, ຖືກ​ນໍາ​ໃຊ້​ເພື່ອ​ທໍາ​ລາຍ​ພັນ​ທະ​ບັດ hydrogen ແລະ​ແຍກ DNA ສອງ​ສາຍ​.
ຈະເກີດຫຍັງຂຶ້ນໃນລະຫວ່າງຂັ້ນຕອນການເຊື່ອມ?	ໃນໄລຍະນີ້, ອຸນຫະພູມຕ່ໍາລົງເພື່ອໃຫ້ primers ຜູກມັດໂດຍສະເພາະກັບລໍາດັບເປົ້າຫມາຍທີ່ສົມບູນຂອງເຂົາເຈົ້າກ່ຽວກັບ DNA ເສັ້ນດຽວ.
ອຸນຫະພູມທີ່ໃຊ້ສໍາລັບຂັ້ນຕອນການຂະຫຍາຍແມ່ນຫຍັງ?	ຂັ້ນຕອນນີ້ມັກຈະເກີດຂຶ້ນຢູ່ທີ່ 72 ° C, ອຸນຫະພູມທີ່ດີທີ່ສຸດສໍາລັບ Taq polymerase ເພື່ອສັງເຄາະສາຍ DNA ໃຫມ່.
ການໄຫຼຂອງອຸນຫະພູມ PCR ແມ່ນຫຍັງ?	ການໄຫຼເຂົ້າປະກອບດ້ວຍຮູບແບບການຖີບລົດຢ່າງໄວວາຂອງອຸນຫະພູມສູງ, ຕ່ໍາ, ແລະປານກາງທີ່ເຮັດຊ້ໍາອີກຈົນກ່ວາຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ຕ້ອງການ.

PCR ແມ່ນຫຍັງ?

PCR, ຫຼື Polymerase Chain Reaction, ແມ່ນວິທີການຊີວະວິທະຍາໂມເລກຸນທີ່ປ່ຽນແປງໄດ້ທີ່ຖືກອອກແບບມາເພື່ອຜະລິດຕົວຢ່າງ DNA ສະເພາະຫຼາຍລ້ານຫາພັນລ້ານສະບັບຢ່າງໄວວາ.

ຢູ່ໃນຫຼັກຂອງມັນ, PCR ເຮັດໜ້າທີ່ເປັນ 'ເຄື່ອງສຳເນົາຊີວະພາບ.' ກ່ອນທີ່ຈະປະດິດສ້າງ, ການຂະຫຍາຍ DNA ເປັນຂະບວນການທີ່ຊ້າ ແລະຫຍຸ້ງຍາກທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການໂຄນ DNA ເຂົ້າໄປໃນເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ. ກັບການມາເຖິງຂອງ ເຄື່ອງ PCR , ນັກຄົ້ນຄວ້າໃນປັດຈຸບັນສາມາດແຍກເຊື້ອສາຍສະເພາະຫຼືສ່ວນຂອງ genome ແລະຂະຫຍາຍມັນໃນສອງສາມຊົ່ວໂມງ. ຄວາມສາມາດນີ້ແມ່ນສໍາຄັນເພາະວ່າການວິເຄາະທາງຊີວະເຄມີສ່ວນໃຫຍ່ຕ້ອງການ DNA ຈໍານວນຫຼວງຫຼາຍເພື່ອໃຫ້ສັນຍານທີ່ສາມາດວັດແທກໄດ້, ແລະຕົວຢ່າງທໍາມະຊາດມັກຈະສະຫນອງພຽງແຕ່ຈໍານວນການຕິດຕາມ.

ຄວາມຄ່ອງແຄ້ວຂອງເທັກໂນໂລຍີນີ້ແມ່ນສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນໃນຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຄໍາຮ້ອງສະຫມັກຂອງມັນໃນທົ່ວອຸດສາຫະກໍາຕ່າງໆ. ໃນການຕັ້ງຄ່າທາງຄລີນິກ, ມັນຖືກໃຊ້ເພື່ອກວດຫາການໂຫຼດຂອງໄວຣັສ, ເຊັ່ນໃນການກວດ COVID-19 ຫຼື HIV. ໃນ forensics, ມັນອະນຸຍາດໃຫ້ນັກສືບສວນສາມາດກໍານົດບຸກຄົນຈາກຕົວຢ່າງກ້ອງຈຸລະທັດຂອງວັດສະດຸຊີວະພາບ. ໃນຂະແຫນງອຸດສາຫະກໍາ, PCR ຮັບປະກັນຄວາມບໍລິສຸດຂອງຜະລິດຕະພັນອາຫານແລະການກວດພົບສິ່ງມີຊີວິດທີ່ດັດແປງພັນທຸກໍາ. ຄວາມເຂົ້າໃຈ ຫຼັກການແລະຄ່າໃຊ້ຈ່າຍຂອງເຕັກໂນໂລຢີ PCR ແມ່ນສໍາຄັນສໍາລັບຫ້ອງທົດລອງທີ່ຊອກຫາເພື່ອຍົກລະດັບຄວາມສາມາດໃນການວິນິດໄສຂອງພວກເຂົາ.

PCR ຕ້ອງການຫຍັງ?

ປະຕິກິລິຍາ PCR ທີ່ປະສົບຜົນສໍາເລັດຕ້ອງການຫ້າອົງປະກອບຫຼັກ: ແບບ DNA, primers ສະເພາະ, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), DNA polymerase ທີ່ທົນທານຕໍ່ຄວາມຮ້ອນ (ເຊັ່ນ Taq), ແລະການແກ້ໄຂ buffer ພິເສດ.

ແມ່ແບບ DNA ໃຊ້ເປັນແຜນຜັງຕົ້ນສະບັບທີ່ທ່ານຕ້ອງການຄັດລອກ. Primers ແມ່ນສັ້ນ, ຊິ້ນສ່ວນສັງເຄາະຂອງ DNA ທີ່ຖືກອອກແບບເອງເພື່ອໃຫ້ກົງກັບຈຸດເລີ່ມຕົ້ນແລະຈຸດສິ້ນສຸດຂອງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ. ຖ້າບໍ່ມີສິ່ງເຫຼົ່ານີ້, DNA polymerase ຈະບໍ່ຮູ້ວ່າຈະເລີ່ມຕົ້ນສ້າງສາຍໃຫມ່ຈາກບ່ອນໃດ. dNTPs (A, T, C, ແລະ G) ແມ່ນສິ່ງກໍ່ສ້າງດິບທີ່ເອນໄຊໃຊ້ເພື່ອສ້າງລະບົບຕ່ອງໂສ້ DNA ໃໝ່.

ສິ່ງທີ່ສໍາຄັນເທົ່າທຽມກັນແມ່ນສະພາບແວດລ້ອມທີ່ຕິກິຣິຍາເກີດຂຶ້ນ. buffer ສະຫນອງສະພາບແວດລ້ອມທາງເຄມີທີ່ຫມັ້ນຄົງ, ໂດຍສະເພາະສຸມໃສ່ pH ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ magnesium ions, ເຊິ່ງເປັນ cofactors ທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບ enzyme DNA polymerase. ສຸດທ້າຍ, ການປະຕິບັດທາງກາຍະພາບຂອງຕິກິຣິຍາຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີເຄື່ອງຈັກຄວາມຮ້ອນທີ່ມີປະສິດຕິພາບສູງ, ມັກຈະເອີ້ນວ່າ ເຄື່ອງ PCR , ເຊິ່ງຄວບຄຸມການປ່ຽນແປງຂອງອຸນຫະພູມຢ່າງໄວວາທີ່ຈໍາເປັນເພື່ອກະຕຸ້ນແຕ່ລະຂັ້ນຕອນຂອງຕິກິຣິຍາ.

ອົງປະກອບຫຼັກຂອງ PCR Mix

1. ແມ່ແບບ DNA : ຕົວຢ່າງທີ່ມີລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ.

2. DNA Polymerase : ປົກກະຕິແລ້ວ Taq polymerase, ເຊິ່ງຍັງຄົງມີການເຄື່ອນໄຫວຢູ່ໃນອຸນຫະພູມສູງ.

3. Primers : ສາຍໄປໜ້າ ແລະ ປີ້ນກັບທີ່ກຳນົດຂອບເຂດການຂະຫຍາຍ.

4. dNTPs : ສີ່ຖານ nucleotide ທີ່ເຮັດໜ້າທີ່ເປັນ 'ຫມຶກ' ສໍາລັບເຄື່ອງສຳເນົາ.

5. Buffer ແລະ Ions : ຮັກສາປະສິດທິພາບຂອງ enzymatic ແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງ.

PCR 4 ຂັ້ນຕອນແມ່ນຫຍັງ?

ຂະບວນການ PCR ປະກອບດ້ວຍສີ່ຂັ້ນຕອນຕົ້ນຕໍ: ການເລີ່ມຕົ້ນ, ການແຍກຕົວ, ການບີບອັດ, ແລະການຂະຫຍາຍ (ຍັງເອີ້ນວ່າການຍືດຍາວ).

ຂັ້ນຕອນທໍາອິດ, ການເລີ່ມຕົ້ນ, ແມ່ນເຫດການຫນຶ່ງຄັ້ງທີ່ຫ້ອງຕິກິຣິຍາຖືກເຮັດໃຫ້ຄວາມຮ້ອນໃນອຸນຫະພູມສູງເພື່ອຮັບປະກັນວ່າ DNA polymerase ຖືກເປີດໃຊ້ຢ່າງເຕັມສ່ວນແລະສິ່ງປົນເປື້ອນໃດໆກໍ່ຖືກເຮັດໃຫ້ເປັນກາງ. ປະຕິບັດຕາມນີ້, ວົງຈອນຂອງ Denaturation ເລີ່ມຕົ້ນ, ບ່ອນທີ່ DNA ຄູ່ສາຍຖືກແຍກອອກ. ນີ້ແມ່ນປະຕິບັດຕາມໂດຍການ Annealing, ບ່ອນທີ່ primers ຊອກຫາເປົ້າຫມາຍຂອງພວກເຂົາ, ແລະສຸດທ້າຍ Extension, ບ່ອນທີ່ DNA ໃຫມ່ຖືກສັງເຄາະ. ວົງຈອນສາມຂັ້ນຕອນນີ້ (Denaturation, Annealing, Extension) ແມ່ນເຮັດຊ້ໍາອີກ 25 ຫາ 40 ເທື່ອ.

ເນື່ອງຈາກວ່າຈໍານວນ DNA ເພີ່ມຂຶ້ນສອງເທົ່າກັບທຸກໆຮອບວຽນທີ່ປະສົບຜົນສໍາເລັດ, ການຂະຫຍາຍຕົວແມ່ນຕົວເລກ. ສໍາລັບຕົວຢ່າງ, ຫຼັງຈາກ 30 ຮອບວຽນ, ໂມເລກຸນ DNA ດຽວສາມາດປ່ຽນເປັນຫຼາຍກວ່າພັນລ້ານສໍາເນົາ. ປະສິດທິພາບນີ້ແມ່ນສິ່ງທີ່ເຮັດໃຫ້ ເຄື່ອງຈັກສູບຄວາມຮ້ອນຫ້ອງທົດລອງທີ່ທັນສະ ໄໝ ມີຄວາມ ຈຳ ເປັນ ສຳ ລັບວິທະຍາສາດທີ່ທັນສະ ໄໝ. ຖ້າບໍ່ມີເຄື່ອງເຮັດຄວາມຮ້ອນແລະຄວາມເຢັນຄວາມໄວສູງທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນ ເຄື່ອງ PCR ທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງ , ຂະບວນການຈະຊ້າເກີນໄປສໍາລັບການນໍາໃຊ້ຕົວຈິງໃນສະພາບແວດລ້ອມການວິນິດໄສທີ່ມີຄວາມໄວສູງ.

ຂັ້ນຕອນເຄື່ອງຈັກ PCR ແມ່ນຫຍັງ?

ຂັ້ນຕອນເຄື່ອງຈັກ PCR ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຮອບວຽນອັດຕະໂນມັດຂອງອຸນຫະພູມໂດຍຜ່ານການຄວບຄຸມເອເລັກໂຕຣນິກທີ່ຊັດເຈນຂອງຕັນຄວາມຮ້ອນ, ການຄຸ້ມຄອງອັດຕາການລ້າ, ເວລາຖື, ແລະຄວາມເຢັນສຸດທ້າຍ.

ເຄື່ອງ PCR ເຮັດວຽກໂດຍການນໍາໃຊ້ອົງປະກອບ Peltier ເພື່ອເຮັດໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢ່າງໄວວາແລະເຢັນຕັນໂລຫະທີ່ຖືທໍ່ປະຕິກິລິຍາ. 'ຂັ້ນຕອນ' ຈາກທັດສະນະຂອງເຄື່ອງຈັກປະກອບມີ 'Ramp,' ເຊິ່ງເປັນຄວາມໄວໃນການປ່ຽນແປງລະຫວ່າງອຸນຫະພູມ, ແລະ 'Hold,' ເຊິ່ງເປັນໄລຍະເວລາທີ່ເຄື່ອງຮັກສາອຸນຫະພູມສະເພາະ. ເຄື່ອງຈັກລະດັບສູງໄດ້ຖືກອອກແບບໃຫ້ມີອັດຕາການລ້າໄວຫຼາຍເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນເວລາທີ່ໃຊ້ໃນການປ່ຽນແປງ, ເຊິ່ງຊ່ວຍຫຼຸດຜ່ອນຄວາມສ່ຽງຂອງການຜູກມັດທີ່ບໍ່ສະເພາະຫຼືການເສື່ອມໂຊມຂອງ enzyme.

ຊອບແວພາຍໃນເຄື່ອງຊ່ວຍໃຫ້ຜູ້ໃຊ້ສາມາດຂຽນໂປໂຕຄອນທີ່ຊັບຊ້ອນ. ນີ້ປະກອບມີການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນເບື້ອງຕົ້ນ, ການຊໍ້າຊ້ອນຂອງສາມຂັ້ນຕອນຕົ້ນຕໍ, ແລະຂັ້ນຕອນສຸດທ້າຍທີ່ຖືຢູ່ໃນອຸນຫະພູມເຢັນ (ປົກກະຕິແລ້ວ 4 ° C) ເພື່ອຮັກສາຕົວຢ່າງຈົນກ່ວານັກວິຊາການສາມາດດຶງພວກມັນຄືນໄດ້. ການໂຕ້ຕອບດິຈິຕອນທີ່ທັນສະໄຫມຢູ່ໃນ ເຄື່ອງ PCR ຍັງອະນຸຍາດໃຫ້ມີການກວດສອບປະຕິກິລິຢາໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງ, ຮັບປະກັນວ່າໂປຣໄຟລ໌ຄວາມຮ້ອນຈະຖືກປະຕິບັດຕາມແນ່ນອນຕາມໂຄງການສໍາລັບການສືບພັນສູງສຸດ.

ອຸນຫະພູມທີ່ໃຊ້ສໍາລັບຂັ້ນຕອນ denature ແມ່ນຫຍັງ?

ຂັ້ນຕອນການແຍກຕົວແບບປົກກະຕິຈະໃຊ້ອຸນຫະພູມລະຫວ່າງ 94°C ແລະ 98°C ເພື່ອສ້າງຄວາມສະດວກໃນການແຕກຫັກຂອງພັນທະບັດ hydrogen ລະຫວ່າງສາຍ DNA.

ໃນຄວາມຮ້ອນທີ່ສຸດນີ້, ໂຄງປະກອບການ double-helix ຂອງ DNA ກາຍເປັນບໍ່ຫມັ້ນຄົງ. ພັນທະບັດໄຮໂດຣເຈນທີ່ຖື adenine-thymine ແລະ cytosine-guanine ຄູ່ກັນໄດ້ລະລາຍ, ສົ່ງຜົນໃຫ້ສອງສາຍດຽວຂອງ DNA ເປັນເອກະລາດ. ນີ້ແມ່ນເງື່ອນໄຂເບື້ອງຕົ້ນທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປ, ຍ້ອນວ່າ primers ແລະ enzyme DNA polymerase ສາມາດພົວພັນກັບແມ່ແບບທີ່ມີສາຍດຽວເທົ່ານັ້ນ. ຖ້າອຸນຫະພູມຕ່ໍາເກີນໄປ, DNA ຈະບໍ່ແຍກອອກຈາກກັນຢ່າງສົມບູນ, ນໍາໄປສູ່ການຂະຫຍາຍທີ່ລົ້ມເຫລວຫຼືບໍ່ມີປະສິດທິພາບ.

ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການຮັກສາອຸນຫະພູມນີ້ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີ DNA polymerase ທີ່ເຂັ້ມແຂງທີ່ສຸດ. ນີ້ແມ່ນເຫດຜົນທີ່ວ່າການຄົ້ນພົບ Taq polymerase, ໂດດດ່ຽວຈາກເຊື້ອແບັກທີເຣັຍທີ່ຮັກຄວາມຮ້ອນ Thermus aquaticus , ແມ່ນການປະຕິວັດຫຼາຍ. enzymes ມາດຕະຖານຈະຖືກທໍາລາຍຢູ່ທີ່ 95 ° C, ແຕ່ Taq ຍັງຄົງເຮັດວຽກ. ຫ້ອງທົດລອງຕ້ອງຮັບປະກັນວ່າ ເຄື່ອງ PCR ຂອງພວກເຂົາ ສະຫນອງຄວາມຮ້ອນທີ່ເປັນເອກະພາບໃນທົ່ວທຸກນ້ໍາເພື່ອປ້ອງກັນ 'ຈຸດເຢັນ' ບ່ອນທີ່ການເກີດຄວາມຫນາແຫນ້ນອາດຈະລົ້ມເຫລວ, ເຊິ່ງເປັນລັກສະນະທີ່ສໍາຄັນຂອງ. ອຸປະກອນຊີວະວິທະຍາໂມເລກຸນທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງ.

ຈະເກີດຫຍັງຂຶ້ນໃນລະຫວ່າງຂັ້ນຕອນການເຊື່ອມຂອງ PCR?

ໃນລະຫວ່າງຂັ້ນຕອນການຫມູນວຽນ, ອຸນຫະພູມຈະຕໍ່າລົງຢູ່ລະຫວ່າງ 50 ° C ແລະ 65 ° C, ອະນຸຍາດໃຫ້ primers DNA ສາມາດຜູກມັດກັບລໍາດັບທີ່ສົມບູນຂອງເຂົາເຈົ້າຢູ່ໃນແມ່ແບບ DNA ສາຍດຽວ.

ຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນສ່ວນທີ່ລະອຽດອ່ອນທີ່ສຸດຂອງຂະບວນການ PCR. ອຸນຫະພູມສະເພາະທີ່ໃຊ້ແມ່ນຂຶ້ນກັບອຸນຫະພູມການລະລາຍ (Tm) ຂອງ primers ທີ່ຖືກນໍາໃຊ້. ຖ້າອຸນຫະພູມສູງເກີນໄປ, primers ຈະບໍ່ຜູກມັດກັບແມ່ແບບ. ຖ້າມັນຕໍ່າເກີນໄປ, primers ອາດຈະຜູກມັດກັບລໍາດັບທີ່ມີພຽງແຕ່ 'ບາງສ່ວນ' ຄ້າຍຄືກັນ, ນໍາໄປສູ່ການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະແລະຜົນໄດ້ຮັບ messy. ເຄື່ອງ PCR ຈະຕ້ອງສາມາດຕີອຸນຫະພູມເປົ້າຫມາຍນີ້ໄດ້ໃນລະດັບຄວາມຖືກຕ້ອງສູງ (ມັກຈະຢູ່ໃນ 0.1 ° C).

ໄລຍະເວລາຂອງຂັ້ນຕອນ annealing ປົກກະຕິແລ້ວແມ່ນ 20 ຫາ 40 ວິນາທີ. ໃນລະຫວ່າງປ່ອງຢ້ຽມສັ້ນໆນີ້, primers ຈະນໍາທາງປະສົມປະຕິກິລິຢາຜ່ານການເຄື່ອນໄຫວໂມເລກຸນແລະ snaps ໃສ່ສະຖານທີ່ເປົ້າຫມາຍ. ເມື່ອ primers ໄດ້ annealed, ພວກເຂົາເຈົ້າສະຫນອງຈຸດເລີ່ມຕົ້ນສໍາລັບ DNA polymerase ເພື່ອເລີ່ມຕົ້ນການເພີ່ມ nucleotides. ການປະສານງານທີ່ຊັດເຈນນີ້ແມ່ນສິ່ງທີ່ອະນຸຍາດໃຫ້ກວດຫາການກາຍພັນທາງພັນທຸກໍາສະເພາະຫຼືເຊື້ອພະຍາດຢູ່ໃນຕົວຢ່າງທາງຊີວະພາບທີ່ຊັບຊ້ອນ, ເຮັດໃຫ້ ການລົງທຶນໃນເຄື່ອງຈັກວິນິດໄສແບບມືອາຊີບເປັນ ບູລິມະສິດສໍາລັບຫ້ອງທົດລອງທາງດ້ານການຊ່ວຍ.

ອຸນຫະພູມທີ່ໃຊ້ສໍາລັບຂັ້ນຕອນການຂະຫຍາຍແມ່ນຫຍັງ?

ຂັ້ນຕອນການຂະຫຍາຍໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 72 ° C, ເຊິ່ງເປັນອຸນຫະພູມທີ່ເຫມາະສົມທີ່ສຸດສໍາລັບ DNA polymerase ທີ່ທົນທານຕໍ່ຄວາມຮ້ອນເພື່ອສັງເຄາະສາຍ DNA ໃຫມ່.

ຢູ່ທີ່ 72 ອົງສາ C, ເອນໄຊ DNA polymerase ແມ່ນຢູ່ໃນປະສິດທິພາບສູງສຸດຂອງມັນ. ມັນເລີ່ມຕົ້ນຢູ່ບ່ອນ primer ແລະເລີ່ມເພີ່ມ dNTPs ໃສ່ປາຍ 3' ຂອງ primer, ເຄື່ອນຍ້າຍຕາມສາຍແມ່ແບບ. ເອນໄຊ 'ອ່ານ' ແມ່ແບບແລະວາງພື້ນຖານເສີມໃນສາຍໃຫມ່. ຕົວຢ່າງ, ຖ້າແມ່ແບບມີ Adenine, polymerase ເພີ່ມ Thymine. ຄວາມໄວຂອງຕິກິຣິຍານີ້ແມ່ນປະທັບໃຈ; Taq polymerase ສາມາດເພີ່ມປະມານ 1,000 ຄູ່ຖານຕໍ່ນາທີ.

ໄລຍະເວລາສໍາລັບຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນຂຶ້ນກັບຄວາມຍາວຂອງສ່ວນ DNA ທີ່ຖືກຄັດລອກ. ຖ້າລໍາດັບເປົ້າຫມາຍແມ່ນ 1,000 ຄູ່ພື້ນຖານຍາວ, ຂັ້ນຕອນການຂະຫຍາຍອາດຈະຖືກຕັ້ງສໍາລັບຫນຶ່ງນາທີ. ຖ້າເປົ້າຫມາຍສັ້ນກວ່າ, ເວລາສາມາດຫຼຸດລົງເພື່ອປະຫຍັດເວລາການປຸງແຕ່ງໂດຍລວມ. ການຮັບປະກັນ ເຄື່ອງ PCR ຮັກສາຄວາມຫມັ້ນຄົງ 72 ° C ຕະຫຼອດໄລຍະນີ້ແມ່ນສໍາຄັນສໍາລັບການສໍາເລັດຂອງສາຍ DNA ທີ່ມີຄວາມຍາວເຕັມ.

ການໄຫຼຂອງອຸນຫະພູມ PCR ແມ່ນຫຍັງ?

ການໄຫຼວຽນຂອງອຸນຫະພູມ PCR ປະຕິບັດຕາມວົງຈອນຊ້ໍາຊ້ອນຂອງ denaturation ຄວາມຮ້ອນສູງ, annealing ຄວາມຮ້ອນຕ່ໍາ, ແລະການຂະຫຍາຍຄວາມຮ້ອນປານກາງ, ການສ້າງໂປຣໄຟລ໌ຄວາມຮ້ອນ 'sawtooth'.

ການໄຫຼເຂົ້ານີ້ຖືກອອກແບບມາເພື່ອເຮັດໃຫ້ຄວາມກ້າວຫນ້າທາງດ້ານເລຂາຄະນິດຂອງປະລິມານ DNA ສູງສຸດ. ໃນ​ການ​ແລ່ນ​ແບບ​ປົກ​ກະ​ຕິ​, ເຄື່ອງ​ຈະ​ເລີ່ມ​ຕົ້ນ​ທີ່ 95°C ສໍາ​ລັບ​ການ 2 ນາ​ທີ (ການ​ປັບ​ຕົວ​ເບື້ອງ​ຕົ້ນ​)​, ຫຼັງ​ຈາກ​ນັ້ນ​ເຂົ້າ​ໄປ​ໃນ​ວົງ​: 95°C ສໍາ​ລັບ 30 ວິ​ນາ​ທີ​, 55°C ສໍາ​ລັບ​ການ 30 ວິ​ນາ​ທີ​, ແລະ 72°C ສໍາ​ລັບ 60 ວິ​ນາ​ທີ​. loop ນີ້ເຮັດເລື້ມຄືນ 30 ເທື່ອ. ສຸດທ້າຍ, ມີ 'ການຂະຫຍາຍສຸດທ້າຍ' ຢູ່ທີ່ 72 ° C ສໍາລັບ 5-10 ນາທີເພື່ອຮັບປະກັນ DNA ສາຍດຽວທັງຫມົດຖືກສາຍສອງຢ່າງຢ່າງເຕັມທີ່ກ່ອນທີ່ເຄື່ອງຈະເຢັນເຖິງ 4 ° C ສໍາລັບການເກັບຮັກສາ.

ຄວາມແມ່ນຍໍາຂອງການໄຫຼຂອງອຸນຫະພູມນີ້ມີຜົນກະທົບໂດຍກົງຕໍ່ຜົນຜະລິດແລະຄວາມບໍລິສຸດຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR. ຖ້າການໄຫຼວຽນບໍ່ສອດຄ່ອງ, ເອນໄຊອາດຈະສູນເສຍການເຄື່ອນໄຫວຫຼື primers ອາດຈະປະກອບເປັນ 'primer dimers,' ເຊິ່ງເປັນສິ່ງປະດິດທີ່ບໍ່ມີປະໂຫຍດທີ່ສໍາຄັນຂອງປະຕິກິລິຍາ. ດ້ວຍເຫດນີ້, ການປັບທຽບແລະຄວາມສອດຄ່ອງຂອງຄວາມຮ້ອນຂອງ ເຄື່ອງ PCR ແມ່ນປັດໃຈສໍາຄັນທີ່ສຸດສໍາລັບຫ້ອງທົດລອງທີ່ປະຕິບັດການວິນິດໄສຫຼືການຄົ້ນຄວ້າໂມເລກຸນ.

ຕາຕະລາງສະຫຼຸບການໄຫຼຂອງອຸນຫະພູມ

ໄລຍະ	ອຸນຫະພູມປົກກະຕິ	ຈຸດປະສົງ
ການເລີ່ມຕົ້ນ	94°C – 96°C	ກະຕຸ້ນ enzyme, denatures DNA ສະລັບສັບຊ້ອນ.
ລັກສະນະ	94°C – 98°C	ແຍກ DNA ສອງສາຍອອກເປັນສາຍດຽວ.
ການຫົດຕົວ	50°C – 65°C	ອະນຸຍາດໃຫ້ primers ຜູກມັດກັບລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ.
ສ່ວນຂະຫຍາຍ	72°C	DNA polymerase ສັງເຄາະສາຍ DNA ໃໝ່.
ຖືສຸດທ້າຍ	4°C – 10°C	ການເກັບຮັກສາໃນໄລຍະສັ້ນຂອງຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນ.

ສະຫຼຸບ

ປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ Polymerase ແມ່ນເຄື່ອງມືທີ່ສະຫງ່າງາມແລະມີອໍານາດທີ່ໄດ້ປະຕິວັດພູມສັນຖານຂອງວິທະຍາສາດຊີວະພາບ. ໂດຍປະຕິບັດຕາມຂັ້ນຕອນທີ່ລະອຽດອ່ອນຂອງ denaturation, annealing, ແລະການຂະຫຍາຍ, ນັກວິທະຍາສາດສາມາດປົດລັອກຄວາມລັບທີ່ມີຢູ່ໃນ DNA, ໃຫ້ຄໍາຕອບຕໍ່ຄໍາຖາມທາງການແພດທີ່ສັບສົນແລະ forensic. ຄວາມສໍາເລັດຂອງຂະບວນການນີ້ແມ່ນຂຶ້ນກັບຄຸນນະພາບຂອງ reagents ແລະຄວາມແມ່ນຍໍາຂອງ ເຄື່ອງ PCR ທີ່ໃຊ້ເພື່ອປະຕິບັດວົງຈອນຄວາມຮ້ອນ.

ສໍາລັບຫ້ອງທົດລອງໃດທີ່ຊອກຫາຜົນໄດ້ຮັບທີ່ສອດຄ່ອງແລະເຊື່ອຖືໄດ້, ຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບ nuances ຂອງການຄວບຄຸມອຸນຫະພູມແລະການຄຸ້ມຄອງວົງຈອນເປັນສິ່ງຈໍາເປັນ. ບໍ່ວ່າທ່ານກໍາລັງດໍາເນີນການຄົ້ນຄ້ວາຂັ້ນພື້ນຖານຫຼືການວິນິດໄສທາງດ້ານຄລີນິກທີ່ມີປະລິມານສູງ, ທາງເລືອກຂອງອຸປະກອນແລະການຍຶດຫມັ້ນກັບໂປໂຕຄອນທີ່ດີທີ່ສຸດຈະກໍານົດຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງວຽກງານຂອງທ່ານ. ສໍາ​ລັບ​ຜູ້​ທີ່​ສົນ​ໃຈ​ໃນ​ດ້ານ​ການ​ຂົນ​ສົ່ງ​ຂອງ​ການ​ສ້າງ​ຕັ້ງ​ຫ້ອງ​ທົດ​ລອງ​ໂມ​ເລ​ກຸນ​, ການ​ສໍາ​ຫຼວດ​ ຄ່າໃຊ້ຈ່າຍແລະຂໍ້ມູນສະເພາະທາງດ້ານວິຊາການຂອງລະບົບ PCR ທີ່ທັນສະໄຫມ ແມ່ນຂັ້ນຕອນທີ່ມີເຫດຜົນຕໍ່ໄປໃນການກ້າວຫນ້າຄວາມສາມາດໃນການວິນິດໄສຂອງທ່ານ.