Ny Reaction Chain Polymerase, fantatra amin'ny anarana hoe PCR, dia maneho ny iray amin'ireo fandrosoana ara-teknolojia lehibe indrindra teo amin'ny tantaran'ny biolojia molekiola. Novolavolaina tamin'ny taona 1980 ity teknika ity dia nifindra avy amin'ny fomba fiasa laboratoara manokana ho fitaovana fototra ampiasaina amin'ny diagnostika ara-pitsaboana, siansa forensika ary fikarohana fototarazo. Amin'ny alalan'ny famelana ny mpahay siansa haka santionany kely amin'ny ADN sy hanamafisana izany ho kopia an-tapitrisany, ny PCR dia nahafahan'ny PCR nandalina ny fototarazo tamin'ny an-tsipiriany, mamantatra ireo otrikaretina amin'ny fomba voafaritra tsara, ary mamantatra ireo marika fototarazo izay tsy hita teo aloha tamin'ny fomba famakafakana mahazatra.
Ny fizotry ny PCR dia teknika laboratoara ampiasaina amin'ny fanaovana dika mitovy amin'ny fizarana ADN manokana amin'ny alàlan'ny tsingerin'ny fiovan'ny mari-pana, misy ny denaturation, ny fanerena, ary ny fanitarana, izay nohamafisin'ny milina PCR manokana sy ny polymerase ADN miorina amin'ny hafanana.
Ny fahatakarana ny saro-pady amin'ny fizotry ny PCR dia tena ilaina ho an'ny matihanina amin'ny laboratoara, mpikaroka ara-pitsaboana ary mpanamboatra indostrialy mandray anjara amin'ny fitaovana fitiliana. Satria tsy mitsaha-mitombo eran'izao tontolo izao ny fangatahana fitiliana molekiola haingana sy marina, ny fahatokisana ny Ny milina PCR dia lasa vato fehizoron'ny vokatra mahomby amin'ny laboratoara. Ity lahatsoratra ity dia manome torolàlana feno momba ny dingana, ny mari-pana ary ny fepetra mekanika amin'ny fizotry ny PCR mba hiantohana ny fanamafisana ny ADN avo lenta sy ny vokatra andrana matanjaka.
Tabilao famintinana ny lahatsoratra
| Faritra |
FAMINTINANA |
| Inona no atao hoe PCR? |
PCR dia teknika biolojia molekiola ampiasaina hanamafisana ny filaharana ADN manokana ho an'ny fampiharana isan-karazany any ambany. |
| Inona no ilaina amin'ny PCR? |
Ny PCR mahomby dia mitaky ADN môdely, primers, nucleotides, polymerase ADN stable, ary mpitaingina hafanana avo lenta. |
| Inona avy ireo dingana 4 amin'ny PCR? |
Ny dingana dia manaraka filaharana lojika amin'ny fanombohana, denaturation, annealing ary fanitarana mba hampitombo avo roa heny ny votoatin'ny ADN isaky ny tsingerina. |
| Inona avy ireo dingana amin'ny milina PCR? |
Ny fitaovana dia manao automatique ny fiovan'ny mari-pana, miantoka ny fihetsehan'ny biochemika hitranga amin'ny elanelana ilaina. |
| Inona ny maripana ampiasaina amin'ny dingana denature? |
Ny mari-pana ambony, matetika eo anelanelan'ny 94°C sy 98°C, dia ampiasaina hanapaka ny fatoran'ny hidrôzenina sy hanasaraka ny ADN misy tady roa. |
| Inona no mitranga mandritra ny dingana annealing? |
Mandritra io dingana io, ahena ny mari-pana mba ahafahan'ny primer mamatotra manokana ny filaharana kendrena mifameno amin'ny ADN tokana. |
| Inona ny maripana ampiasaina amin'ny dingana fanitarana? |
Ity dingana ity dia mitranga matetika amin'ny 72 ° C, ny mari-pana tsara indrindra ho an'ny Taq polymerase mba hamoronana tady ADN vaovao. |
| Inona ny fikorianan'ny mari-pana PCR? |
Ny fikorianan'ny dia misy lamina mandeha bisikileta haingana amin'ny mari-pana ambony, ambany ary antonony izay miverimberina mandra-pahatongan'ny fifantohana irina. |
Inona no atao hoe PCR?
PCR, na Polymerase Chain Reaction, dia fomba biolojia molekiola manovaova natao hamokatra haingana an-tapitrisa ka hatramin'ny miliara amin'ny santionany ADN manokana.
Amin'ny fotony, ny PCR dia miasa ho toy ny 'photocopier biolojika.' Talohan'ny namoronana azy, ny fanamafisana ny ADN dia dingana miadana sy sarotra amin'ny fanaovana kloning ny ADN ho bakteria. Miaraka amin'ny fahatongavan'ny Masinina PCR , ny mpikaroka dia afaka manasaraka fototarazo manokana na ampahany amin'ny génomé ary manamafy izany ao anatin'ny ora vitsivitsy. Tena ilaina izany fahaiza-manao izany satria ny ankamaroan'ny famakafakana biolojika dia mitaky ADN be dia be mba hahazoana famantarana azo refesina, ary ny santionany voajanahary matetika dia tsy manome afa-tsy habe.
Ny fahaizan'ity teknolojia ity dia hita taratra amin'ny fampiharana isan-karazany amin'ny indostria samihafa. Ao amin'ny toeram-pitsaboana dia ampiasaina hamantarana ny viriosy, toy ny amin'ny fitiliana COVID-19 na VIH. Ao amin'ny forensika, mamela ny mpanao fanadihadiana hamantatra ny olona avy amin'ny santionany biolojika biolojika. Ao amin'ny sehatry ny indostria, ny PCR dia miantoka ny fahadiovan'ny vokatra sakafo sy ny fahitana ireo zavamananaina novaina. Fahatakarana ny Ny fitsipika sy ny vidin'ny teknolojia PCR dia zava-dehibe ho an'ny laboratoara mitady hanatsara ny fahaiza-manao diagnostika.
Inona no ilaina amin'ny PCR?
Ny fanehoan-kevitra PCR mahomby dia mitaky singa fototra dimy: ny môdely ADN, ny primer manokana, ny deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), ny polymerase ADN mahamay (toy ny Taq), ary ny vahaolana buffer manokana.
Ny môdelin'ny ADN no drafi-drafitra tany am-boalohany tianao halaina. Ny voalohany dia ampahany fohy sy sentetika amin'ny ADN izay natao manokana hifanaraka amin'ny fiandohana sy ny fiafaran'ny filaharana kendrena. Raha tsy misy ireo, dia tsy ho fantatry ny polymerase ADN hoe aiza no hanombohan'ilay tady vaovao. Ny dNTPs (A, T, C, ary G) no singa fototra ampiasain'ny enzyme hanamboarana ny rojo ADN vaovao.
Zava-dehibe mitovy amin'izany ny tontolo iainana misy ny fanehoan-kevitra. Ny buffer dia manome tontolo simika tsy miovaova, indrindra mifantoka amin'ny pH sy ny fitanan'ny ion magnesium, izay cofactors tena ilaina ho an'ny anzima polymerase ADN. Farany, ny famonoana ara-batana ny fanehoan-kevitra dia mitaky cycler thermaly avo lenta, izay matetika antsoina hoe milina PCR , izay mifehy tsara ny fiovan'ny mari-pana haingana ilaina amin'ny dingana tsirairay amin'ny fanehoan-kevitra.
Ireo singa fototra amin'ny PCR Mix
ADN template : Ny santionany misy ny filaharana kendrena.
ADN Polymerase : Matetika ny Taq polymerase, izay mijanona ho mavitrika amin'ny hafanana ambony.
Primers : Tady mandroso sy miverina izay mamaritra ny fetran'ny fanamafisana.
dNTPs : Ny fototra nucleotide efatra izay miasa ho toy ny 'mainty' ho an'ny copier.
Buffer sy Ion : Mitazona ny fahombiazan'ny enzymatic sy ny fahamarinan-toerana.
Inona avy ireo dingana 4 amin'ny PCR?
Ny fizotry ny PCR dia misy dingana efatra miasa voalohany: Initialization, Denaturation, Annealing, ary Extension (fantatra ihany koa amin'ny hoe Elongation).
Ny dingana voalohany, Initialization, dia hetsika indray mandeha izay nafanaina tamin'ny hafanana avo ny efitrano fanehoan-kevitra mba hahazoana antoka fa mavitrika tanteraka ny polymerase ADN ary tsy misy loto. Aorian'izany dia manomboka ny tsingerin'ny Denaturation, izay misaraka ny ADN misy tady roa. Izany dia arahin'ny Annealing, izay ahitan'ny primers ny tanjony, ary farany Extension, izay ahitana ny ADN vaovao. Averina in-25 ka hatramin'ny in-40 io tsingerina telo io (Denaturation, Annealing, Extension).
Satria mitombo avo roa heny ny habetsahan'ny ADN amin'ny tsingerina mahomby rehetra, dia mihamitombo ny fitomboana. Ohatra, aorian’ny tsingerina 30, ny molekiolan’ny ADN iray dia azo avadika ho iray arivo tapitrisa mahery. Izany fahombiazana izany no mahatonga cyclers thermal laboratoara maoderina tena ilaina amin'ny siansa maoderina. Raha tsy misy bloc fanafanana sy fampangatsiahana haingam-pandeha hita ao amin'ny avo lenta milina PCR , dia ho miadana be ny fizotrany raha azo ampiasaina amin'ny tontolo diagnostika avo lenta.
Inona avy ireo dingana amin'ny milina PCR?
Ny dingana amin'ny milina PCR dia misy ny fihodinan'ny mari-pana mandeha ho azy amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso elektronika marina amin'ny sakana mafana, ny fitantanana ny tahan'ny ramp, ny fotoana fihazonana ary ny fampangatsiahana farany.
Ny milina PCR dia miasa amin'ny fampiasana singa Peltier mba hanafanana haingana sy hampangatsiaka ny sakana metaly izay mitazona ny fantsona fanehoan-kevitra. Ny 'dingana' avy amin'ny fomba fijerin'ny milina dia ahitana ny 'Ramp', izay ny hafainganam-pandehan'ny fifindrana eo amin'ny mari-pana, ary ny 'Hold', izay ny faharetan'ny milina mitazona mari-pana manokana. Ny milina avo lenta dia natao hanana taham-pandeha haingana be mba hampihenana ny fotoana lany amin'ny tetezamita, izay mampihena ny mety hisian'ny fatorana tsy voafaritra manokana na ny fahasimban'ny enzyme.
Ny rindrankajy ao anatin'ilay milina dia ahafahan'ny mpampiasa manao programa protocols sarotra. Tafiditra ao anatin'izany ny hafanana voalohany, ny tadivavarana miverimberina amin'ireo dingana telo lehibe, ary ny dingana fihazonana farany amin'ny hafanana mangatsiaka (matetika 4°C) mba hitahiry ireo santionany mandra-pahazoan'ny teknisianina azy ireo. Ny fifandraisana nomerika maoderina amin'ny milina PCR dia mamela ny fanaraha-maso amin'ny fotoana tena izy ny fanehoan-kevitra, miantoka fa ny mombamomba ny thermal dia arahana araka ny efa nomanina mba hamerenana ambony indrindra.
Inona ny maripana ampiasaina amin'ny dingana denature?
Ny dingana denaturation matetika dia mampiasa ny mari-pana eo anelanelan'ny 94°C sy 98°C mba hanamora ny fatoran'ny hidrôzenina eo amin'ny tady ADN.
Amin'izao hafanana faran'izay mafy izao, dia lasa tsy marin-toerana ny firafitry ny ADN. Ny fatoran'ny hydrogène izay mitazona ny adenine-thymine sy cytosine-guanine mpivady miaraka dia miempo, ka miteraka tady ADN tokana tsy miankina. Izany dia fepetra takiana ho an'ny dingana manaraka, satria ny primer sy ny anzima polymerase ADN dia tsy afaka mifandray afa-tsy amin'ny môdely tokana. Raha ambany loatra ny mari-pana, dia tsy hisaraka tanteraka ny ADN, ka miteraka tsy fahombiazana na tsy mahomby.
Na izany aza, ny fitazonana an'io mari-pana io dia mitaky polymerase ADN tena matanjaka. Izany no nahatonga ny fahitana ny Taq polymerase, mitoka-monina amin'ny bakteria tia hafanana Thermus aquaticus , ho revolisionera. Ny anzima mahazatra dia ho potika amin'ny 95 ° C, fa ny Taq dia mbola miasa. Ny laboratoara dia tsy maintsy miantoka fa ny milina PCR dia manome fanamafisam-peo mitovitovy amin'ny fantsakana rehetra mba hisorohana ny 'toerana mangatsiaka' izay mety tsy hahomby ny denaturation, izay singa fototra amin'ny fitaovana biolojika molekiola avo lenta.
Inona no mitranga mandritra ny dingana fanodinkodinana ny PCR?
Mandritra ny dingan'ny fametahana dia ahena ho eo anelanelan'ny 50°C sy 65°C ny mari-pana, ahafahan'ny primer ADN mamatotra ny filaharany mifameno amin'ireo lasitra ADN tokana.
Ity dingana ity dia azo lazaina fa ampahany saro-pady indrindra amin'ny fizotry ny PCR. Ny mari-pana manokana ampiasaina dia miankina amin'ny mari-pana mitsonika (Tm) an'ireo primer ampiasaina. Raha avo loatra ny mari-pana, dia tsy hifatotra amin'ny môdely ny primers. Raha ambany loatra ilay izy, dia mety hifamatotra amin'ny filaharana izay 'ampahany' mitovitovy ihany ny voalohany, ka miteraka fanamafisam-peo tsy voafaritra sy vokatra mikorontana. Ny milina PCR dia tsy maintsy mahavita mamely io mari-pana kendrena io amin'ny mari-pahaizana ambony (matetika ao anatin'ny 0,1 ° C).
Matetika 20 ka hatramin'ny 40 segondra ny faharetan'ny dingana fanodinkodinana. Mandritra io varavarankely fohy io, ny primer dia mivezivezy amin'ny fifangaroan'ny fanehoan-kevitra amin'ny alàlan'ny hetsika molekiola ary mipetaka amin'ny toerana kendrena. Rehefa tapitra ny primers, dia manome toerana fiaingana ho an'ny polymerase ADN izy ireo hanomboka hampiditra nucleotides. Io fandrindrana mazava io no ahafahana mamantatra ny fiovan'ny fototarazo manokana na pathogen ao anaty santionany biolojika sarotra, ka mahatonga ny fampiasam-bola amin'ny milina diagnostika matihanina no laharam-pahamehana ho an'ny laboratoara klinika.
Inona ny maripana ampiasaina amin'ny dingana fanitarana?
Ny dingana fanitarana amin'ny ankapobeny dia atao amin'ny 72 ° C, izay ny mari-pana miasa tsara indrindra ho an'ny polymerase ADN mahamay mba hanambatra ny tady ADN vaovao.
Amin'ny 72 ° C, ny anzima polymerase ADN dia eo amin'ny fahombiazany ambony indrindra. Manomboka eo amin'ny toerana voalohany izy io ary manomboka manampy dNTPs amin'ny faran'ny 3' amin'ny primer, mandeha amin'ny tady môdely. Ny anzima 'mamaky' ny môdely ary mametraka ny fototra mifameno ao amin'ilay kofehy vaovao. Ohatra, raha manana Adenine ny môdely, dia manampy Thymine ny polymerase. Mahavariana ny hafainganan'ity fanehoan-kevitra ity; Ny polymerase Taq dia afaka manampy tsiroaroa fototra 1000 isa-minitra.
Ny halavan'ny fotoana hanaovana an'io dingana io dia miankina amin'ny halavan'ny fizarana ADN adika. Raha 1.000 ny halavan'ny filaharana kendrena, dia azo apetraka mandritra ny iray minitra ny dingana fanitarana. Raha fohy kokoa ny tanjona, dia azo ahena ny fotoana mba hamonjena ny fotoana fanodinana amin'ny ankapobeny. Ny fiantohana ny milina PCR dia mitazona hafanana 72°C mandritra ity dingana ity dia tena ilaina amin'ny famitana ny tady ADN manontolo.
Inona ny fikorianan'ny mari-pana PCR?
Ny fikorianan'ny mari-pana amin'ny PCR dia manaraka tsingerina miverimberina amin'ny denaturation hafanana be, fanafoanana ny hafanana ambany, ary fanitarana hafanana antonony, mamorona profil mafana 'sawtooth'.
Ity fikoriana ity dia natao hampitomboana ny fivoaran'ny geometrika amin'ny habetsahan'ny ADN. Amin'ny hazakazaka mahazatra, ny milina dia manomboka amin'ny 95 ° C mandritra ny 2 minitra (Denaturation voalohany), avy eo miditra amin'ny loop: 95 ° C mandritra ny 30 segondra, 55 ° C mandritra ny 30 segondra, ary 72 ° C mandritra ny 60 segondra. Miverina in-30 ity tady ity. Farany, misy ny 'Final Extension' amin'ny 72°C mandritra ny 5-10 minitra mba hahazoana antoka fa ny ADN tokana tokana dia mipetaka roa tanteraka alohan'ny hampangatsiaka ny milina hatramin'ny 4°C ho fitahirizana.
Ny fahamarinan'ity fikorianan'ny mari-pana ity dia misy fiantraikany mivantana amin'ny vokatra sy ny fahadiovan'ny vokatra PCR. Raha tsy mifanaraka ny fikorianan'ny dia, dia mety ho very asa ny anzima na ny primer dia mety hamorona 'primer dimer', izay tena tsy misy ilàna azy ny fanehoan-kevitra. Noho izany, ny calibration sy ny fanamiana mafana amin'ny milina PCR no antony lehibe indrindra amin'ny laboratoara manao diagnostika na fikarohana molekiola.
Tabilao famintinana ny fikorianan'ny maripana
| dingana |
Temperature mahazatra |
Zava-kendreny |
| Initialization |
94°C – 96°C |
Mampihetsi-po anzima, denatures ADN complex. |
| Denaturation |
94°C – 98°C |
Manasaraka ny ADN misy tady roa ho tady tokana. |
| Fanafody |
50°C – 65°C |
Avelao ny primer mba hamatotra amin'ny filaharana kendrena. |
| Fanitarana |
72°C |
Ny ADN polymerase dia mamorona tady ADN vaovao. |
| Fihazonana farany |
4°C – 10°C |
Fitehirizana fohy ny vokatra amplified. |
Famaranana
Ny Polymerase Chain Reaction dia fitaovana kanto sy mahery izay nanova ny tontolon'ny siansa biolojika. Amin'ny alàlan'ny fanarahana ireo dingana marim-pototra amin'ny denaturation, annealing ary fanitarana, ny mpahay siansa dia afaka manokatra ny tsiambaratelo ao anatin'ny ADN, manome valiny amin'ireo fanontaniana ara-pitsaboana sy forensika sarotra. Ny fahombiazan'ity dingana ity dia miankina betsaka amin'ny kalitaon'ny reagents sy ny fahamarinan'ny milina PCR ampiasaina amin'ny fanatanterahana ny tsingerina mafana.
Ho an'ny laboratoara rehetra mitady vokatra tsy miovaova sy azo ianteherana, dia ilaina ny mahatakatra ny nuance amin'ny fanaraha-maso ny mari-pana sy ny fitantanana tsingerina. Na manao fikarohana fototra na diagnostika klinika be dia be ianao, ny fisafidianana fitaovana sy ny fanarahana ireo protocole efa nohatsaraina dia hamaritra ny fahamarinan'ny asanao. Ho an'ireo liana amin'ny lafiny lozisialy amin'ny fananganana laboratoara molekiola, mikaroka ny Ny vidiny sy ny famaritana ara-teknika ny rafitra PCR maoderina no dingana lojika manaraka amin'ny fampivoarana ny fahaiza-manao diagnostika.
