ПГУ гэгддэг Полимеразын гинжин урвал нь молекул биологийн түүхэн дэх хамгийн чухал технологийн нээлтүүдийн нэг юм. 1980-аад онд бүтээгдсэн энэ техник нь лабораторийн нарийн мэргэжлийн үйл ажиллагаанаас эмнэлгийн оношилгоо, шүүх эмнэлэг, генетикийн судалгаанд ашигладаг үндсэн хэрэгсэлд шилжсэн. Эрдэмтэд ДНХ-ийн өчүүхэн дээж авч, олон сая хувь болгон олшруулах боломжийг олгосноор ПГУ нь генийг нарийвчлан судлах, эмгэг төрүүлэгчдийг маш нарийвчлалтайгаар илрүүлэх, урьд өмнө нь стандарт аналитик аргуудад үл үзэгдэх генетикийн маркеруудыг тодорхойлох боломжтой болсон.
ПГУ-ын процесс нь тусгай ПГУ-ын машин, халуунд тэсвэртэй ДНХ полимеразын тусламжтайгаар хөнгөвчлөх, температурын өөрчлөлт, денатураци, анялах, сунгалтыг оролцуулан тодорхой ДНХ сегментийн олон хуулбарыг хийхэд ашигладаг лабораторийн арга юм.
ПГУ-ын үйл явцын нарийн төвөгтэй байдлыг ойлгох нь оношилгооны тоног төхөөрөмжөөр ажилладаг лабораторийн мэргэжилтнүүд, эмнэлгийн судлаачид, үйлдвэрлэлийн үйлдвэрлэгчдэд зайлшгүй шаардлагатай. Дэлхий даяар хурдан бөгөөд үнэн зөв молекулын туршилтын эрэлт хэрэгцээ өссөөр байгаа тул тэдгээрийн найдвартай байдал ПГУ-ын аппарат нь лабораторийн амжилттай үр дүнгийн тулгын чулуу болдог. Энэ нийтлэл нь ДНХ-ийн өндөр чанартай олшруулалт, найдвартай туршилтын үр дүнг баталгаажуулахын тулд ПГУ-ын үйл явцын үе шат, температур, механик шаардлагуудын талаархи дэлгэрэнгүй гарын авлагыг өгдөг.
Нийтлэлийн хураангуй хүснэгт
| Хэсэг |
Дүгнэлт |
| ПГУ гэж юу вэ? |
ПГУ нь молекулын биологийн техник юм. |
| ПГУ-д юу шаардлагатай вэ? |
Амжилттай ПГУ-ын хувьд загвар ДНХ, праймер, нуклеотид, тогтвортой ДНХ полимераз, өндөр нарийвчлалтай дулааны циклер шаардлагатай. |
| ПГУ-ын 4 үе шат юу вэ? |
Уг процесс нь мөчлөг бүрт ДНХ-ийн агуулгыг хоёр дахин нэмэгдүүлэхийн тулд эхлүүлэх, денатураци, анивалт, өргөтгөлийн логик дарааллыг дагаж мөрддөг. |
| ПГУ-ын машин ямар алхамууд вэ? |
Тоног төхөөрөмж нь температурын нарийн шилжилтийг автоматжуулж, биохимийн урвалыг яг шаардлагатай интервалаар хийдэг. |
| Денатурацийн үе шатанд ямар температурыг ашигладаг вэ? |
Устөрөгчийн холбоог таслах, хоёр судалтай ДНХ-ийг салгахад ихэвчлэн 94 ° C-аас 98 ° C-ийн өндөр температурыг ашигладаг. |
| Хатаах үе шатанд юу тохиолддог вэ? |
Энэ үе шатанд праймерууд нэг судалтай ДНХ-ийн нэмэлт зорилтот дараалалд тусгайлан холбогдохын тулд температурыг бууруулна. |
| Өргөтгөх алхамд ямар температур ашигладаг вэ? |
Энэ үе шат нь ихэвчлэн 72 ° C-д тохиолддог бөгөөд энэ нь Так полимеразын шинэ ДНХ хэлхээг нийлэгжүүлэх оновчтой температур юм. |
| ПГУ-ын температурын урсгал гэж юу вэ? |
Урсгал нь хүссэн концентрацид хүрэх хүртэл давтагдах өндөр, бага, дунд температурын хурдацтай эргэлтийг агуулдаг. |
ПГУ гэж юу вэ?
ПГУ буюу Полимеразын гинжин урвал нь тодорхой ДНХ-ийн дээжийг хэдэн саяас хэдэн тэрбум хувь хурдан гаргах зориулалттай хувиргагч молекул биологийн арга юм.
Үндсэндээ ПГУ нь 'биологийн хувилагч'-ын үүргийг гүйцэтгэдэг. ДНХ-г олшруулах нь ДНХ-ийг бактери болгон хуваахтай холбоотой удаан бөгөөд төвөгтэй үйл явц байсан. гарч ирснээр ПГУ-ын машин , судлаачид одоо геномын тодорхой ген эсвэл сегментийг тусгаарлаж, хэдхэн цагийн дотор олшруулж чадна. Ихэнх биохимийн шинжилгээнд хэмжигдэхүйц дохио өгөхийн тулд их хэмжээний ДНХ шаардагддаг бөгөөд байгалийн дээж нь зөвхөн ул мөрийн хэмжээг өгдөг тул энэ чадвар нь маш чухал юм.
Энэхүү технологийн олон талт байдал нь янз бүрийн салбар дахь олон төрлийн хэрэглээнд тусгагдсан байдаг. Эмнэлзүйн нөхцөлд үүнийг COVID-19 эсвэл ХДХВ-ийн шинжилгээ зэрэг вирусын ачааллыг илрүүлэхэд ашигладаг. Шүүх эмнэлгийн хувьд энэ нь мөрдөн байцаагчдад биологийн материалын микроскопийн дээжээс хувь хүнийг тодорхойлох боломжийг олгодог. Аж үйлдвэрийн салбарт ПГУ нь хүнсний бүтээгдэхүүний цэвэр байдал, генийн өөрчлөлттэй организмыг илрүүлэх боломжийг олгодог. -ийг ойлгох ПГУ-ын технологийн зарчим, зардал нь оношлогооны чадавхийг сайжруулахыг эрэлхийлж буй лабораториудад маш чухал юм.
ПГУ-д юу шаардлагатай вэ?
Амжилттай ПГУ-ын урвал нь ДНХ загвар, тусгай праймерууд, дезоксинуклеотид трифосфатууд (dNTPs), халуунд тэсвэртэй ДНХ полимераз (Taq гэх мэт) болон тусгай буферийн уусмал зэрэг таван үндсэн бүрэлдэхүүн хэсэг шаарддаг.
ДНХ-ийн загвар нь таны хуулбарлахыг хүссэн анхны зураглал болж өгдөг. Праймерууд нь зорилтот дарааллын эхлэл ба төгсгөлд тохируулан тусгайлан бүтээгдсэн богино, синтетик ДНХ хэсгүүд юм. Эдгээргүйгээр ДНХ полимераз нь шинэ хэлхээг хаанаас эхлэхээ мэдэхгүй байх болно. dNTPs (A, T, C, G) нь ферментийн шинэ ДНХ-ийн гинжийг бий болгоход ашигладаг түүхий барилгын материал юм.
Үүнтэй адил чухал зүйл бол урвал явагдах орчин юм. Буфер нь химийн тогтвортой орчныг бүрдүүлдэг бөгөөд ялангуяа ДНХ полимеразын ферментийн чухал кофакторууд болох рН болон магнийн ионуудын концентрацид анхаарлаа хандуулдаг. Эцэст нь, урвалын биет гүйцэтгэл нь ПГУ-ын машин гэж нэрлэгддэг өндөр хүчин чадалтай дулааны циклийг шаарддаг.урвалын үе шат бүрийг эхлүүлэхэд шаардлагатай температурын хурдан өөрчлөлтийг нарийн хянадаг
ПГУ-ын хольцын гол бүрэлдэхүүн хэсгүүд
Загвар ДНХ : Зорилтот дарааллыг агуулсан дээж.
ДНХ полимераз : Ихэвчлэн өндөр температурт идэвхтэй байдаг Так полимераз.
Праймерууд : Олшруулалтын хил хязгаарыг тодорхойлдог урагш ба урвуу хэлхээ.
dNTPs : Хувилагчийн 'бэх' болдог дөрвөн нуклеотидын суурь.
Буфер ба ионууд : Ферментийн үр ашиг, тогтвортой байдлыг хангана.
ПГУ-ын 4 үе шат юу вэ?
ПГУ-ын процесс нь үндсэн дөрвөн үйл ажиллагааны үе шатаас бүрдэнэ: Эхлүүлэх, Денатураци, Ангилах, Өргөтгөх (мөн сунгалт гэж нэрлэдэг).
Эхний үе шат болох 'Эхлүүлэх' нь ДНХ полимеразыг бүрэн идэвхжүүлж, аливаа бохирдуулагчийг саармагжуулахын тулд урвалын камерыг өндөр температурт халаадаг нэг удаагийн арга хэмжээ юм. Үүний дараа денатурацийн мөчлөг эхэлж, хоёр хэлхээтэй ДНХ тусгаарлагдана. Үүний дараа праймерууд зорилтоо олдог Annealing, эцэст нь шинэ ДНХ нийлэгждэг Extension явагдана. Энэ гурван үе шаттай мөчлөг (Денатураци, анивчилгаа, өргөтгөл) нь 25-40 удаа давтагдана.
Амжилттай мөчлөг бүрт ДНХ-ийн хэмжээ хоёр дахин нэмэгддэг тул өсөлт нь экспоненциал болдог. Жишээлбэл, 30 мөчлөгийн дараа ДНХ-ийн нэг молекул тэрбум гаруй хувь болж хувирдаг. Энэ нь бүтээмжийг бий болгодог орчин үеийн лабораторийн дулааны цикл . Өндөр чанартай Орчин үеийн шинжлэх ухаанд зайлшгүй шаардлагатай өндөр хурдтай халаах, хөргөх блок байхгүй бол ПГУ-ын машинд процесс нь өндөр хүчин чадалтай оношлогооны орчинд практик ашиглахад хэтэрхий удаан байх болно.
ПГУ-ын машин ямар алхамууд вэ?
ПГУ-ын машины алхмууд нь дулааны блокийн нарийн цахим хяналт, налуу хурд, барих хугацаа, эцсийн хөргөлтийг удирдах замаар температурын автомат эргэлтийг агуулдаг.
ПГУ -ын машин нь Пелтье элементүүдийг ашиглан урвалын хоолой барьж буй металл блокыг хурдан халааж, хөргөнө. Машины үүднээс авч үзвэл 'алхмууд' нь температур хоорондын шилжилтийн хурд болох 'Налуу' ба машин тодорхой температурыг хадгалах хугацаа болох 'Холд'-ыг агуулдаг. Дээд зэрэглэлийн машинууд нь шилжилтийн үед зарцуулсан цагийг багасгахын тулд маш хурдан налуу хурдтай байхаар бүтээгдсэн бөгөөд энэ нь өвөрмөц бус холболт эсвэл ферментийн задралын эрсдлийг бууруулдаг.
Машин доторх програм хангамж нь хэрэглэгчдэд нарийн төвөгтэй протоколуудыг програмчлах боломжийг олгодог. Үүнд эхний халаалт, гурван үндсэн үе шатыг давтах гогцоонууд, техникийн ажилтан авах хүртэл дээжийг хадгалахын тулд хүйтэн температурт (ихэвчлэн 4 ° C) эцсийн барих үе шат орно. дээрх орчин үеийн дижитал интерфэйсүүд ПГУ-ын машин нь урвалыг бодит цаг хугацаанд хянах боломжийг олгодог бөгөөд дулааны профайлыг хамгийн их давтагдахын тулд програмчлагдсаны дагуу яг дагаж мөрддөг.
Денатурацийн үе шатанд ямар температурыг ашигладаг вэ?
Денатурацийн үе шат нь ДНХ-ийн хэлхээ хоорондын устөрөгчийн холбоог таслахын тулд ихэвчлэн 94 ° C-аас 98 ° C-ийн температурыг ашигладаг.
Энэ хэт халуунд ДНХ-ийн давхар спираль бүтэц тогтворгүй болдог. Аденин-тимин ба цитозин-гуаниныг холбосон устөрөгчийн холбоо хайлж, ДНХ-ийн бие даасан хоёр хэлхээ үүсдэг. Праймерууд болон ДНХ полимеразын фермент нь зөвхөн нэг судалтай загвартай харилцан үйлчилж чаддаг тул энэ нь дараагийн алхмуудын чухал урьдчилсан нөхцөл юм. Хэрэв температур хэт бага байвал ДНХ бүрэн салахгүй бөгөөд энэ нь амжилтгүй эсвэл үр ашиггүй олшроход хүргэдэг.
Гэсэн хэдий ч энэ температурыг хадгалахын тулд маш хүчтэй ДНХ полимераз шаардлагатай. Ийм учраас халуунд дуртай Thermus aquaticus нянгаас тусгаарлагдсан Так полимеразыг нээсэн нь үнэхээр хувьсгал болсон юм. Стандарт ферментүүд 95 хэмд устах боловч Taq нь үйл ажиллагаагаа явуулдаг. Лабораториуд ПГУ-ын төхөөрөмж нь бүх цооногийг жигд халааж, денатураци амжилтгүй болох 'хүйтэн цэгүүд'-ээс урьдчилан сэргийлэх ёстой. өндөр чанартай молекул биологийн тоног төхөөрөмж.
ПГУ-ын үе шатанд юу тохиолддог вэ?
Бэхжүүлэх үе шатанд температурыг 50 ° C-аас 65 ° C хүртэл бууруулж, ДНХ праймерууд нь нэг хэлхээтэй ДНХ загварууд дээр нэмэлт дарааллаар холбогддог.
Энэ алхам нь ПГУ-ын процессын хамгийн эмзэг хэсэг юм. Ашигласан тусгай температур нь хэрэглэж буй праймеруудын хайлах температураас (Tm) хамаарна. Хэрэв температур хэт өндөр байвал праймерууд загварт наалдахгүй. Хэрэв энэ нь хэтэрхий бага байвал праймерууд нь зөвхөн 'хэсэгчилсэн' ижил төстэй дарааллаар холбогдож, өвөрмөц бус өсгөлт болон эмх замбараагүй үр дүнд хүргэж болзошгүй. ПГУ -ын машин нь энэ зорилтот температурыг өндөр нарийвчлалтайгаар (ихэвчлэн 0.1 ° C дотор) цохих чадвартай байх ёстой.
Хагалах үе шат нь ихэвчлэн 20-40 секунд байдаг. Энэхүү товч цонхны үеэр праймерууд нь молекулын хөдөлгөөнөөр урвалын хольцыг чиглүүлж, зорилтот талбарт наалддаг. Праймерууд хатсаны дараа ДНХ полимераза нь нуклеотид нэмж эхлэх эхлэлийн цэг болдог. Энэхүү нарийн зохицуулалт нь нарийн төвөгтэй биологийн дээжинд өвөрмөц генетик мутаци эсвэл эмгэг төрүүлэгчийг илрүүлэх боломжийг олгодог. мэргэжлийн оношлогооны машинд хөрөнгө оруулалт хийх нь клиник лабораторийн тэргүүлэх чиглэл юм.
Өргөтгөх алхамд ямар температур ашигладаг вэ?
Өргөтгөх үе шат нь ерөнхийдөө 72°C-т явагддаг бөгөөд энэ нь ДНХ-ийн шинэ хэлхээг нийлэгжүүлэх дулаанд тэсвэртэй ДНХ полимеразагийн хамгийн оновчтой температур юм.
72°С-т ДНХ полимеразын фермент хамгийн дээд үр ашигтай байдаг. Энэ нь праймерын талбайгаас эхэлж, праймерын 3' төгсгөлд dNTP-ийг нэмж, загварын хэлхээний дагуу хөдөлж эхэлдэг. Фермент нь загварыг 'уншиж' ба нэмэлт суурийг шинэ хэлхээнд байрлуулна. Жишээлбэл, загвар нь Аденинтэй бол полимераз нь Тиминийг нэмдэг. Энэ урвалын хурд нь гайхалтай юм; Так полимераз нь минутанд 1000 орчим суурь хос нэмж чаддаг.
Энэ алхамын үргэлжлэх хугацаа нь хуулбарлаж буй ДНХ-ийн сегментийн уртаас хамаарна. Хэрэв зорилтот дараалал нь 1000 үндсэн хос урттай бол өргөтгөлийн алхамыг нэг минутаар тохируулж болно. Хэрэв зорилтот хугацаа богино бол нийт боловсруулалтын хугацааг хэмнэхийн тулд хугацааг багасгаж болно. ПГУ -ын машиныг энэ үе шатанд 72°С хэмд тогтвортой байлгах нь ДНХ-ийн бүрэн хэмжээний хэлхээг дуусгахад нэн чухал юм.
ПГУ-ын температурын урсгал гэж юу вэ?
ПГУ-ын температурын урсгал нь өндөр дулааны денатураци, бага дулаантай анивалт, дунд зэргийн дулааны өргөтгөлийн давтагдах циклийг дагаж, 'хөрөөний шүд' дулааны профилийг үүсгэдэг.
Энэ урсгал нь ДНХ-ийн хэмжигдэхүүний геометрийн прогрессийг нэмэгдүүлэх зорилготой юм. Ердийн гүйлтийн үед машин 2 минутын турш 95 ° C температурт эхэлдэг (Анхны денатураци), дараа нь гогцоонд ордог: 30 секундын турш 95 ° C, 30 секундын турш 55 ° C, 60 секундын турш 72 ° C байна. Энэ давталт 30 удаа давтана. Эцэст нь машиныг хадгалахад зориулж 4°С хүртэл хөргөхөөс өмнө бүх нэг судалтай ДНХ бүрэн давхар судалтай байхын тулд 72°С-т 5-10 минутын турш 'Эцсийн өргөтгөл' байдаг.
Энэ температурын урсгалын нарийвчлал нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүний гарц, цэвэр байдалд шууд нөлөөлдөг. Хэрэв урсгал зөрчилдвөл ферментийн үйл ажиллагаа алдагдах эсвэл праймерууд нь 'праймер димер' үүсгэдэг бөгөөд энэ нь урвалын үндсэндээ ашиггүй олдвор юм. Ийм учраас ПГУ-ын төхөөрөмжийн шалгалт тохируулга, дулааны жигд байдал нь молекулын оношлогоо, судалгаа хийдэг аливаа лабораторид хамгийн чухал хүчин зүйл болдог.
Температурын урсгалын хураангуй хүснэгт
| Үе шат |
Ердийн температур |
Зорилго |
| Эхлүүлэх |
94 ° C - 96 ° C |
Ферментийг идэвхжүүлж, нарийн төвөгтэй ДНХ-ийг денатурат болгодог. |
| Денатураци |
94 ° C - 98 ° C |
Давхар хэлхээтэй ДНХ-ийг нэг хэлхээ болгон тусгаарлана. |
| Хатаах |
50 ° C - 65 ° C |
Праймеруудыг зорилтот дараалалд холбохыг зөвшөөрдөг. |
| Өргөтгөл |
72 хэм |
ДНХ полимераз нь ДНХ-ийн шинэ хэлхээг нэгтгэдэг. |
| Эцсийн хүлээлт |
4 ° C - 10 ° C |
Олшруулсан бүтээгдэхүүнийг богино хугацаанд хадгалах. |
Дүгнэлт
Полимеразын гинжин урвал нь биологийн шинжлэх ухааны ландшафтыг өөрчилсөн гоёмсог бөгөөд хүчирхэг хэрэгсэл юм. Эрдэмтэд денатураци, нөхөн сэргээх, сунгах зэрэг нарийн алхмуудыг дагаснаар ДНХ-ийн нууцыг нээж, эмнэлгийн болон шүүх эмнэлгийн нарийн төвөгтэй асуултуудад хариулт өгч чадна. Энэ процессын амжилт нь урвалжуудын чанар, ПГУ-ын төхөөрөмжийн нарийвчлалаас ихээхэн хамаардаг. дулааны циклийг гүйцэтгэхэд ашигладаг
Тогтвортой, найдвартай үр дүнд хүрэхийг хүсч буй аливаа лабораторийн хувьд температурын хяналт, мөчлөгийн менежментийн нарийн ширийн зүйлийг ойлгох нь чухал юм. Та суурь судалгаа эсвэл их хэмжээний эмнэлзүйн оношлогоо хийж байгаа эсэхээс үл хамааран тоног төхөөрөмжийн сонголт, оновчтой протоколыг дагаж мөрдөх нь таны ажлын нарийвчлалыг тодорхойлно. Молекулын лаборатори байгуулах ложистикийн талыг сонирхож буй хүмүүст зориулж, судлах Орчин үеийн ПГУ-ын системийн өртөг, техникийн үзүүлэлтүүд нь таны оношлогооны чадавхийг дээшлүүлэх дараагийн логик алхам юм.
