Idahun Pq Polymerase, ti a mọ ni gbogbogbo si PCR, duro fun ọkan ninu awọn aṣeyọri imọ-ẹrọ pataki julọ ninu itan-akọọlẹ isedale molikula. Ti dagbasoke ni awọn ọdun 1980, ilana yii ti yipada lati ilana yàrá amọja si ohun elo ipilẹ ti a lo ninu awọn iwadii iṣoogun, imọ-jinlẹ iwaju, ati iwadii jiini. Nipa gbigba awọn onimo ijinlẹ sayensi laaye lati mu ayẹwo kekere ti DNA ki o pọ si sinu awọn miliọnu awọn ẹda, PCR ti jẹ ki o ṣee ṣe lati ṣe iwadi awọn Jiini ni awọn alaye, ṣe awari awọn ọlọjẹ pẹlu pipe to gaju, ati ṣe idanimọ awọn asami jiini ti o jẹ alaihan tẹlẹ si awọn ọna itupalẹ boṣewa.
Ilana PCR jẹ imọ-ẹrọ yàrá ti a lo lati ṣe awọn adakọ pupọ ti apakan DNA kan pato nipasẹ ọna ti awọn iyipada iwọn otutu, pẹlu denaturation, annealing, ati itẹsiwaju, ti o ni irọrun nipasẹ ẹrọ PCR pataki kan ati DNA polymerase ti o duro gbigbona.
Loye awọn intricacies ti ilana PCR jẹ pataki fun awọn alamọdaju yàrá, awọn oniwadi iṣoogun, ati awọn aṣelọpọ ile-iṣẹ ti o ni ipa ninu ohun elo iwadii. Bi ibeere fun iyara ati idanwo molikula deede tẹsiwaju lati dagba ni kariaye, igbẹkẹle ti Ẹrọ PCR di okuta igun-ile ti awọn abajade yàrá aṣeyọri. Nkan yii n pese itọsọna okeerẹ si awọn igbesẹ, awọn iwọn otutu, ati awọn ibeere ẹrọ ti ilana PCR lati rii daju imudara DNA ti o ga julọ ati awọn abajade esiperimenta to lagbara.
Ìwé Lakotan Table
| Abala |
Lakotan |
| Kini PCR? |
PCR jẹ ilana ilana isedale molikula ti a lo lati ṣe alekun awọn ilana DNA kan pato fun ọpọlọpọ awọn ohun elo isalẹ. |
| Kini o nilo fun PCR? |
PCR ti o ṣaṣeyọri nilo DNA awoṣe kan, awọn alakoko, awọn nucleotides, DNA polymerase ti o duro, ati gigun kẹkẹ igbona to gaju. |
| Kini awọn igbesẹ mẹrin ti PCR? |
Ilana naa tẹle ilana ti ọgbọn ti ipilẹṣẹ, denaturation, annealing, ati itẹsiwaju lati ilọpo meji akoonu DNA ni iyipo kọọkan. |
| Kini awọn igbesẹ ẹrọ PCR? |
Ohun elo naa ṣe adaṣe awọn iyipada iwọn otutu deede, ni idaniloju pe awọn aati biokemika waye ni awọn aaye arin deede ti o nilo. |
| Kini iwọn otutu ti a lo fun igbesẹ denatu? |
Awọn iwọn otutu ti o ga julọ, ni deede laarin 94°C ati 98°C, ni a lo lati fọ awọn ifunmọ hydrogen ati sọtọ DNA oni-meji. |
| Kini yoo ṣẹlẹ lakoko igbesẹ annealing? |
Lakoko ipele yii, iwọn otutu ti dinku lati gba awọn alakoko laaye lati so ni pato si awọn ilana ibi-afẹde ibaramu wọn lori DNA oni-okun kan. |
| Kini iwọn otutu ti a lo fun igbesẹ itẹsiwaju? |
Igbesẹ yii maa nwaye ni 72°C, iwọn otutu to dara julọ fun Taq polymerase lati ṣajọpọ okun DNA tuntun kan. |
| Kini sisan iwọn otutu PCR? |
Sisan naa pẹlu ilana gigun kẹkẹ iyara ti giga, kekere, ati awọn iwọn otutu alabọde ti o tun ṣe titi ti ifọkansi ti o fẹ yoo ti de. |
Kini PCR?
PCR, tabi Polymerase Chain Reaction, jẹ ọna isedale molikula iyipada ti a ṣe apẹrẹ lati ṣe agbejade awọn miliọnu si awọn ọkẹ àìmọye idaako ti ayẹwo DNA kan pato.
Ni ipilẹ rẹ, PCR n ṣe bi ' photocopier ti ibi.' Ṣaaju ki o to ṣẹda rẹ, imudara DNA jẹ ilana ti o lọra ati lile ti o kan didi DNA sinu kokoro arun. Pẹlu awọn dide ti awọn Ẹrọ PCR , awọn oniwadi le ni bayi sọtọ jiini kan pato tabi apakan ti jiini ati ki o pọ si ni ọrọ ti awọn wakati. Agbara yii ṣe pataki nitori pupọ julọ awọn itupale biokemika nilo iye pataki ti DNA lati fun ifihan agbara wiwọn kan, ati pe awọn ayẹwo adayeba nigbagbogbo pese awọn iye itọpa nikan.
Iyatọ ti imọ-ẹrọ yii jẹ afihan ni ọpọlọpọ awọn ohun elo ti o yatọ si awọn ile-iṣẹ oriṣiriṣi. Ni awọn eto ile-iwosan, a lo lati ṣe awari awọn ẹru ọlọjẹ, gẹgẹbi ninu COVID-19 tabi idanwo HIV. Ni awọn oniwadi, o gba awọn oniwadi laaye lati ṣe idanimọ awọn ẹni-kọọkan lati awọn ayẹwo airi ti ohun elo ti ibi. Ni eka ile-iṣẹ, PCR ṣe idaniloju mimọ ti awọn ọja ounjẹ ati wiwa ti awọn ohun alumọni ti a ṣe atunṣe. Agbọye awọn awọn ilana ati awọn idiyele ti imọ-ẹrọ PCR jẹ pataki fun awọn ile-iṣẹ n wa lati ṣe igbesoke awọn agbara iwadii aisan wọn.
Kini o nilo fun PCR?
Idahun PCR aṣeyọri nilo awọn paati pataki marun: awoṣe DNA, awọn alakoko kan pato, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), polymerase DNA ti o duro gbigbona (bii Taq), ati ojutu ifipamọ pataki kan.
Awoṣe DNA n ṣiṣẹ bi apẹrẹ atilẹba ti o fẹ daakọ. Awọn alakoko jẹ kukuru, awọn ege sintetiki ti DNA ti o jẹ apẹrẹ ti aṣa lati baamu ibẹrẹ ati ipari ti ọkọọkan ibi-afẹde. Laisi iwọnyi, DNA polymerase kii yoo mọ ibiti yoo bẹrẹ kikọ okun tuntun naa. Awọn dNTPs (A, T, C, ati G) jẹ awọn bulọọki ile aise ti enzymu nlo lati kọ pq DNA tuntun.
Paapaa pataki ni agbegbe ti iṣesi naa waye. Ifipamọ n pese agbegbe kemikali iduroṣinṣin, ni pataki ni idojukọ pH ati ifọkansi ti awọn ions iṣuu magnẹsia, eyiti o jẹ awọn oludasiṣẹ pataki fun henensiamu polymerase DNA. Lakotan, ipaniyan ti ara ti ifarabalẹ nilo cycler igbona ti o ga julọ, nigbagbogbo tọka si bi ẹrọ PCR , eyiti o ṣakoso ni deede awọn iyipada iwọn otutu iyara ti o nilo lati ṣe okunfa ipele kọọkan ti iṣe.
Awọn paati bọtini ti Mix PCR
DNA awoṣe : Apeere ti o ni ọna ibi-afẹde ninu.
DNA Polymerase : Nigbagbogbo Taq polymerase, eyiti o wa lọwọ ni awọn iwọn otutu giga.
Awọn alakoko : Siwaju ati yiyipada awọn okun ti o ṣalaye awọn aala imudara.
dNTPs : Awọn ipilẹ nucleotide mẹrin ti o ṣiṣẹ bi 'inki' fun oludaakọ.
Ifipamọ ati awọn ions : Ṣe itọju ṣiṣe enzymatic ati iduroṣinṣin.
Kini awọn igbesẹ mẹrin ti PCR?
Ilana PCR ni awọn ipele iṣẹ akọkọ mẹrin: Ibẹrẹ, Denaturation, Annealing, and Extension (tun mọ bi Elongation).
Ipele akọkọ, Ibẹrẹ, jẹ iṣẹlẹ ti akoko kan nibiti iyẹwu ifura ti gbona si iwọn otutu ti o ga lati rii daju pe DNA polymerase ti mu ṣiṣẹ ni kikun ati pe eyikeyi contaminants ti yọkuro. Lẹhin eyi, iyipo ti Denaturation bẹrẹ, nibiti DNA ti o ni okun meji ti yapa. Eyi ni atẹle nipasẹ Annealing, nibiti awọn alakoko ti rii awọn ibi-afẹde wọn, ati nikẹhin Ifaagun, nibiti DNA tuntun ti ṣepọ. Yiyi-igbesẹ mẹta yii (Denaturation, Annealing, Extension) tun ṣe ni igba 25 si 40.
Nitoripe iye DNA ṣe ilọpo meji pẹlu gbogbo iyipo aṣeyọri, idagba jẹ iwọn. Fún àpẹẹrẹ, lẹ́yìn ọgbọ̀n yíyò, molecule kan ṣoṣo ti DNA lè di ẹ̀dà bílíọ̀nù kan. Yi ṣiṣe ni ohun ti ki asopọ igbalode yàrá gbona cyclers ki pataki fun igbalode Imọ. Laisi alapapo iyara ati awọn bulọọki itutu agbaiye ti a rii ni ẹrọ PCR ti o ga julọ , ilana naa yoo lọra pupọ fun lilo ilowo ni awọn agbegbe iwadii giga-giga.
Kini awọn igbesẹ ẹrọ PCR?
Awọn igbesẹ ẹrọ PCR pẹlu gigun kẹkẹ adaṣe adaṣe ti awọn iwọn otutu nipasẹ iṣakoso itanna deede ti bulọọki igbona, ṣiṣakoso iwọn rampu, akoko idaduro, ati itutu agbaiye.
kan Ẹrọ PCR n ṣiṣẹ nipa lilo awọn eroja Peltier lati yara yara gbona ati ki o tutu bulọọki irin ti o di awọn tubes ifaseyin mu. Awọn 'Igbese' lati irisi ẹrọ naa pẹlu 'Ramp,' eyi ti o jẹ iyara iyipada laarin awọn iwọn otutu, ati 'Dimu,' eyi ti o jẹ iye akoko ti ẹrọ naa ṣe itọju iwọn otutu kan pato. Awọn ẹrọ ti o ga julọ jẹ apẹrẹ lati ni awọn oṣuwọn rampu iyara pupọ lati dinku akoko ti o lo ni iyipada, eyiti o dinku eewu ti isọdọkan ti kii ṣe pato tabi ibajẹ enzymu.
Sọfitiwia laarin ẹrọ n gba awọn olumulo laaye lati ṣe eto awọn ilana ilana eka. Eyi pẹlu gbigbona akọkọ, awọn iṣipopada ti awọn ipele akọkọ mẹta, ati igbesẹ idaduro ipari ni otutu otutu (nigbagbogbo 4 ° C) lati tọju awọn ayẹwo titi ti onimọ-ẹrọ yoo le gba wọn pada. Awọn atọkun oni-nọmba ode oni lori ẹrọ PCR tun gba laaye fun ibojuwo akoko gidi ti iṣesi, ni idaniloju pe profaili igbona ti wa ni atẹle ni deede bi eto fun isọdọtun ti o pọju.
Kini iwọn otutu ti a lo fun igbesẹ denatu?
Igbesẹ denaturation nigbagbogbo nlo awọn iwọn otutu laarin 94°C ati 98°C lati dẹrọ fifọ awọn ifunmọ hydrogen laarin awọn okun DNA.
Ni gbigbona ti o pọju yii, ọna-ipamọ-meji ti DNA di riru. Awọn ìde hydrogen ti o di adenine-thymine ati awọn orisii cytosine-guanine mu papọ yo kuro, ti o mu ki awọn okun DNA olominira meji ti o ni ominira. Eyi jẹ ohun pataki ṣaaju fun awọn igbesẹ ti nbọ, bi awọn alakoko ati henensiamu polymerase DNA le ṣe ajọṣepọ pẹlu awọn awoṣe ti o ni okun nikan. Ti iwọn otutu ba lọ silẹ ju, DNA kii yoo yapa ni kikun, ti o yori si ikuna tabi ailagbara ailagbara.
Sibẹsibẹ, mimu iwọn otutu yii nilo polymerase DNA ti o lagbara pupọju. Eyi ni idi ti iṣawari ti Taq polymerase, ti o ya sọtọ lati ooru-ife bacterium Thermus aquaticus , jẹ iyipada pupọ. Awọn enzymu boṣewa yoo parẹ ni 95°C, ṣugbọn Taq wa ni iṣẹ ṣiṣe. Awọn ile-iwosan gbọdọ rii daju pe wọn ẹrọ PCR pese alapapo aṣọ ni gbogbo awọn kanga lati ṣe idiwọ 'awọn aaye tutu' nibiti denaturation le kuna, eyiti o jẹ ẹya pataki ti ohun elo isedale molikula didara.
Kini yoo ṣẹlẹ lakoko igbesẹ annealing ti PCR?
Lakoko igbesẹ annealing, iwọn otutu ti dinku si laarin 50°C ati 65°C, gbigba awọn alakoko DNA laaye lati so mọ awọn ilana ibaramu wọn lori awọn awoṣe DNA oni-okun kan.
Igbesẹ yii jẹ ijiyan apakan ifura julọ ti ilana PCR. Iwọn otutu pato ti a lo da lori iwọn otutu yo (Tm) ti awọn alakoko ti a lo. Ti iwọn otutu ba ga ju, awọn alakoko ko ni sopọ mọ awoṣe naa. Ti o ba ti lọ silẹ ju, awọn alakoko le so mọ awọn ilana ti o jọra nikan 'apakan', ti o yori si imudara ti kii ṣe pato ati awọn abajade idoti. Ẹrọ PCR gbọdọ ni anfani lati kọlu iwọn otutu ibi-afẹde yii pẹlu iwọn giga ti deede (nigbagbogbo laarin 0.1°C).
Iye akoko igbesẹ annealing jẹ igbagbogbo 20 si 40 awọn aaya. Lakoko ferese kukuru yii, awọn alakọbẹrẹ ṣe lilö kiri ni idapọ iṣesi nipasẹ iṣipopada molikula ki o tẹri mọ aaye ibi-afẹde. Ni kete ti awọn alakoko ba ti parẹ, wọn pese aaye ibẹrẹ fun polymerase DNA lati bẹrẹ fifi awọn nucleotides kun. Iṣọkan kongẹ yii jẹ ohun ti ngbanilaaye fun wiwa ti awọn iyipada jiini kan pato tabi awọn aarun ajakalẹ-arun ninu apẹẹrẹ ti ẹda ti o nipọn, ṣiṣe idoko-owo ni awọn ẹrọ iwadii ọjọgbọn jẹ pataki fun awọn laabu ile-iwosan.
Kini iwọn otutu ti a lo fun igbesẹ itẹsiwaju?
Igbesẹ itẹsiwaju naa ni a ṣe ni gbogbogbo ni 72°C, eyiti o jẹ iwọn otutu iṣẹ ṣiṣe ti o dara julọ fun polymerase DNA-iduroṣinṣin ooru lati ṣajọpọ okun DNA tuntun.
Ni 72°C, enzymu DNA polymerase wa ni iṣẹ ṣiṣe ti o ga julọ. O bẹrẹ ni aaye alakoko ati bẹrẹ fifi awọn dNTP kun si 3 'ipari ti alakoko, gbigbe pẹlu okun awoṣe. Enzymu 'ka' awoṣe naa o si fi ipilẹ ibaramu sinu okun tuntun. Fun apẹẹrẹ, ti awoṣe ba ni Adenine, polymerase ṣe afikun Thymine kan. Iyara ti iṣesi yii jẹ iwunilori; Taq polymerase le ṣafikun nipa awọn orisii ipilẹ 1,000 fun iṣẹju kan.
Gigun akoko fun igbesẹ yii da lori ipari ti apa DNA ti a daakọ. Ti ọna ibi-afẹde ba jẹ 1,000 awọn orisii ipilẹ gigun, igbesẹ itẹsiwaju le ṣee ṣeto fun iṣẹju kan. Ti ibi-afẹde ba kuru, akoko le dinku lati ṣafipamọ akoko ṣiṣe gbogbogbo. Aridaju pe ẹrọ PCR n ṣetọju iduro 72°C jakejado ipele yii jẹ pataki fun ipari awọn okun DNA ni kikun.
Kini sisan iwọn otutu PCR?
Ṣiṣan iwọn otutu PCR tẹle ọna ti atunwi ti denaturation ooru-giga, annealing ooru kekere, ati itẹsiwaju-iwọntunwọnsi, ṣiṣẹda profaili gbigbona 'sawtooth'.
Ṣiṣan yii jẹ apẹrẹ lati mu ilọsiwaju jiometirika ti opoiye DNA pọ si. Ni ṣiṣe deede, ẹrọ naa bẹrẹ ni 95 ° C fun awọn iṣẹju 2 (Denaturation Ibẹrẹ), lẹhinna wọ inu lupu kan: 95°C fun awọn aaya 30, 55°C fun awọn aaya 30, ati 72°C fun awọn aaya 60. Yi lupu tun 30 igba. Nikẹhin, 'Ipari Ipari' wa ni 72°C fun iṣẹju 5-10 lati rii daju pe gbogbo DNA ti o ni okun kan ti ni okun ni kikun ni kikun ṣaaju ki ẹrọ naa tutu si 4°C fun ibi ipamọ.
Itọkasi ti ṣiṣan iwọn otutu yii taara ni ipa lori ikore ati mimọ ti ọja PCR. Ti sisan naa ko ba ni ibamu, henensiamu le padanu iṣẹ ṣiṣe tabi awọn alakoko le ṣẹda 'awọn dimers alakoko,' eyiti o jẹ awọn ohun-ini asan ti iṣesi. Nitori eyi, isọdiwọn ati isokan gbona ti ẹrọ PCR jẹ awọn ifosiwewe pataki julọ fun eyikeyi yàrá ti n ṣe awọn iwadii molikula tabi iwadii.
Lakotan Table of otutu Sisan
| Ipele |
Aṣoju iwọn otutu |
Idi |
| Ibẹrẹ |
94°C – 96°C |
Mu enzymu ṣiṣẹ, denatures eka DNA. |
| Denaturation |
94°C – 98°C |
Ṣe iyatọ DNA ti o ni okun meji si awọn okun ẹyọkan. |
| Annealing |
50°C – 65°C |
Faye gba awọn alakoko lati dipọ si awọn ilana ibi-afẹde. |
| Itẹsiwaju |
72°C |
DNA polymerase ṣepọ awọn okun DNA tuntun. |
| Idaduro ipari |
4°C – 10°C |
Ibi ipamọ igba kukuru ti ọja imudara. |
Ipari
Idahun Pq Polymerase jẹ ohun elo didara ati agbara ti o ti yi ilẹ-ilẹ ti awọn imọ-jinlẹ ti ibi pada. Nípa títẹ̀lé àwọn ìṣísẹ̀ líle koko ti denaturation, annealing, and extension, àwọn onímọ̀ sáyẹ́ǹsì lè ṣí àwọn ohun ìkọ̀kọ̀ tí ó wà nínú DNA sílẹ̀, ní pípèsè àwọn ìdáhùn sí àwọn ìbéèrè oníṣègùn dídíjú àti oníṣègùn. Aṣeyọri ti ilana yii jẹ igbẹkẹle pupọ lori didara awọn reagents ati konge ẹrọ PCR ti a lo lati ṣiṣẹ awọn iyipo igbona.
Fun eyikeyi yàrá ti n wa lati ṣaṣeyọri deede ati awọn abajade igbẹkẹle, agbọye awọn nuances ti iṣakoso iwọn otutu ati iṣakoso ọmọ jẹ pataki. Boya o n ṣe iwadii ipilẹ tabi awọn iwadii ile-iwosan iwọn-giga, yiyan ohun elo ati ifaramọ si awọn ilana iṣapeye yoo ṣalaye deede ti iṣẹ rẹ. Fun awon ti nife ninu awọn eekaderi ẹgbẹ ti eto soke a molikula lab, ṣawari awọn awọn idiyele ati awọn alaye imọ-ẹrọ ti awọn eto PCR ode oni jẹ igbesẹ ọgbọn atẹle ni ilọsiwaju awọn agbara iwadii rẹ.
