ដំណាក់កាលនៃប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ Polymerase (PCR)

ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ Polymerase ដែលត្រូវបានគេស្គាល់យ៉ាងទូលំទូលាយថាជា PCR តំណាងឱ្យរបកគំហើញបច្ចេកវិទ្យាដ៏សំខាន់បំផុតមួយនៅក្នុងប្រវត្តិសាស្រ្តនៃជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល។ ត្រូវបានបង្កើតឡើងក្នុងទសវត្សរ៍ឆ្នាំ 1980 បច្ចេកទេសនេះបានផ្លាស់ប្តូរពីនីតិវិធីមន្ទីរពិសោធន៍ឯកទេសទៅជាឧបករណ៍មូលដ្ឋានដែលប្រើក្នុងការវិភាគវេជ្ជសាស្រ្ត វិទ្យាសាស្ត្រកោសល្យវិច្ច័យ និងការស្រាវជ្រាវហ្សែន។ ដោយអនុញ្ញាតឱ្យអ្នកវិទ្យាសាស្ត្រយកគំរូ DNA តូចមួយហើយពង្រីកវាទៅជារាប់លានច្បាប់ចម្លង PCR បានធ្វើឱ្យវាអាចសិក្សាហ្សែនយ៉ាងលម្អិត រកឃើញភ្នាក់ងារបង្កជំងឺដោយភាពជាក់លាក់ខ្លាំង និងកំណត់អត្តសញ្ញាណហ្សែនដែលពីមុនមើលមិនឃើញចំពោះវិធីសាស្ត្រវិភាគស្តង់ដារ។

ដំណើរការ PCR គឺជាបច្ចេកទេសមន្ទីរពិសោធន៍ដែលប្រើដើម្បីធ្វើច្បាប់ចម្លងជាច្រើននៃផ្នែក DNA ជាក់លាក់មួយតាមរយៈវដ្តនៃការផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាព ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការ denaturation, annealing និង extension ដែលសម្របសម្រួលដោយម៉ាស៊ីន PCR ឯកទេស និង DNA polymerase ដែលមានស្ថេរភាពកំដៅ។

ការស្វែងយល់ពីភាពស្មុគ្រស្មាញនៃដំណើរការ PCR គឺចាំបាច់សម្រាប់អ្នកជំនាញមន្ទីរពិសោធន៍ អ្នកស្រាវជ្រាវផ្នែកវេជ្ជសាស្រ្ត និងក្រុមហ៊ុនផលិតឧស្សាហកម្មដែលពាក់ព័ន្ធនឹងឧបករណ៍វិនិច្ឆ័យ។ នៅពេលដែលតម្រូវការសម្រាប់ការធ្វើតេស្តម៉ូលេគុលលឿន និងត្រឹមត្រូវនៅតែបន្តកើនឡើងជាសកល ភាពជឿជាក់នៃ ម៉ាស៊ីន PCR ក្លាយជាមូលដ្ឋានគ្រឹះនៃលទ្ធផលមន្ទីរពិសោធន៍ជោគជ័យ។ អត្ថបទនេះផ្តល់នូវការណែនាំដ៏ទូលំទូលាយអំពីជំហាន សីតុណ្ហភាព និងតម្រូវការមេកានិចនៃដំណើរការ PCR ដើម្បីធានាបាននូវការពង្រីក DNA ដែលមានគុណភាពខ្ពស់ និងលទ្ធផលពិសោធន៍ដ៏រឹងមាំ។

តារាងសង្ខេបអត្ថបទ

ផ្នែក	សង្ខេប
PCR ជាអ្វី?	PCR គឺជាបច្ចេកទេសជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលដែលប្រើដើម្បីពង្រីកលំដាប់ DNA ជាក់លាក់សម្រាប់កម្មវិធីខាងក្រោមផ្សេងៗ។
តើ PCR ត្រូវការអ្វីខ្លះ?	PCR ដែលទទួលបានជោគជ័យទាមទារគំរូ DNA, primers, nucleotides, DNA polymerase ដែលមានស្ថេរភាព និងម៉ាស៊ីនកំដៅដែលមានភាពជាក់លាក់ខ្ពស់។
តើ ៤ ជំហាននៃ PCR មានអ្វីខ្លះ?	ដំណើរការនេះធ្វើតាមលំដាប់ឡូជីខលនៃការចាប់ផ្តើម ការប្រែពណ៌ ការស្រោប និងផ្នែកបន្ថែម ដើម្បីបង្កើនមាតិកា DNA ទ្វេដងនៃវដ្តនីមួយៗ។
តើជំហានម៉ាស៊ីន PCR មានអ្វីខ្លះ?	គ្រឿងបរិក្ខារស្វ័យប្រវត្តិកម្មការផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាពយ៉ាងជាក់លាក់ ដោយធានាថា ប្រតិកម្មជីវគីមីកើតឡើងនៅចន្លោះពេលដែលត្រូវការពិតប្រាកដ។
តើសីតុណ្ហភាពដែលប្រើសម្រាប់ជំហាន denature គឺជាអ្វី?	សីតុណ្ហភាពខ្ពស់ ជាធម្មតាចន្លោះពី 94°C និង 98°C ត្រូវបានប្រើដើម្បីបំបែកចំណងអ៊ីដ្រូសែន និង DNA ពីរខ្សែដាច់ដោយឡែក។
តើមានអ្វីកើតឡើងក្នុងដំណាក់កាល annealing?	ក្នុងដំណាក់កាលនេះ សីតុណ្ហភាពត្រូវបានបន្ទាប ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យ primers ភ្ជាប់ជាពិសេសទៅនឹងលំដាប់គោលដៅបំពេញបន្ថែមរបស់ពួកគេនៅលើ DNA ខ្សែតែមួយ។
តើសីតុណ្ហភាពដែលប្រើសម្រាប់ជំហានបន្ថែមគឺជាអ្វី?	ជំហាននេះជាធម្មតាកើតឡើងនៅសីតុណ្ហភាព 72°C ដែលជាសីតុណ្ហភាពល្អបំផុតសម្រាប់ Taq polymerase ដើម្បីសំយោគខ្សែ DNA ថ្មី។
តើលំហូរសីតុណ្ហភាព PCR គឺជាអ្វី?	លំហូរនេះពាក់ព័ន្ធនឹងលំនាំជិះកង់យ៉ាងលឿននៃសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ ទាប និងមធ្យម ដែលធ្វើម្តងទៀតរហូតដល់ការប្រមូលផ្តុំដែលចង់បាន។

PCR ជាអ្វី?

PCR ឬ Polymerase Chain Reaction គឺជាវិធីសាស្ត្រជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលបំប្លែងដែលបានរចនាឡើងដើម្បីផលិតយ៉ាងឆាប់រហ័សនូវគំរូ DNA ជាក់លាក់ពីរាប់លានទៅរាប់ពាន់លានច្បាប់ចម្លង។

នៅស្នូលរបស់វា PCR ដើរតួជា 'ម៉ាស៊ីនថតចម្លងជីវសាស្រ្ត។' មុនពេលការបង្កើតរបស់វា ការពង្រីក DNA គឺជាដំណើរការយឺត និងស្មុគស្មាញដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការក្លូន DNA ទៅជាបាក់តេរី។ ជាមួយនឹងវត្តមានរបស់អេ ម៉ាស៊ីន PCR ឥឡូវនេះអ្នកស្រាវជ្រាវអាចញែកហ្សែនជាក់លាក់មួយ ឬផ្នែកនៃហ្សែន និងពង្រីកវាក្នុងរយៈពេលប៉ុន្មានម៉ោង។ សមត្ថភាពនេះមានសារៈសំខាន់ណាស់ ពីព្រោះការវិភាគជីវគីមីភាគច្រើនទាមទារបរិមាណ DNA យ៉ាងច្រើន ដើម្បីផ្តល់សញ្ញាដែលអាចវាស់វែងបាន ហើយសំណាកធម្មជាតិតែងតែផ្តល់តែបរិមាណដានប៉ុណ្ណោះ។

ភាពប៉ិនប្រសប់នៃបច្ចេកវិទ្យានេះត្រូវបានឆ្លុះបញ្ចាំងនៅក្នុងកម្មវិធីចម្រុះរបស់វានៅទូទាំងឧស្សាហកម្មផ្សេងៗគ្នា។ នៅក្នុងការកំណត់គ្លីនិក វាត្រូវបានប្រើដើម្បីរកមើលការផ្ទុកមេរោគ ដូចជានៅក្នុងការធ្វើតេស្ត COVID-19 ឬមេរោគអេដស៍។ នៅក្នុងកោសល្យវិច្ច័យ វាអនុញ្ញាតឱ្យអ្នកស៊ើបអង្កេតកំណត់អត្តសញ្ញាណបុគ្គលពីគំរូមីក្រូទស្សន៍នៃសម្ភារៈជីវសាស្រ្ត។ នៅក្នុងវិស័យឧស្សាហកម្ម PCR ធានានូវភាពបរិសុទ្ធនៃផលិតផលអាហារ និងការរកឃើញនៃសារពាង្គកាយដែលបានកែប្រែហ្សែន។ ការយល់ដឹងអំពី គោលការណ៍ និងការចំណាយនៃបច្ចេកវិទ្យា PCR គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់មន្ទីរពិសោធន៍ដែលកំពុងស្វែងរកការធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវសមត្ថភាពវិនិច្ឆ័យរបស់ពួកគេ។

តើ PCR ត្រូវការអ្វីខ្លះ?

ប្រតិកម្ម PCR ជោគជ័យទាមទារសមាសធាតុស្នូលចំនួនប្រាំ៖ គំរូ DNA បឋមជាក់លាក់ សារធាតុ deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) DNA polymerase ដែលមានស្ថេរភាពកំដៅ (ដូចជា Taq) និងដំណោះស្រាយសតិបណ្ដោះអាសន្នឯកទេស។

គំរូ DNA បម្រើជាប្លង់មេដើមដែលអ្នកចង់ចម្លង។ Primers គឺខ្លី បំណែកសំយោគនៃ DNA ដែលត្រូវបានរចនាឡើងផ្ទាល់ខ្លួន ដើម្បីផ្គូផ្គងការចាប់ផ្តើម និងចុងបញ្ចប់នៃលំដាប់គោលដៅ។ បើគ្មានវាទេ DNA polymerase នឹងមិនដឹងថាត្រូវចាប់ផ្តើមសាងសង់ខ្សែថ្មីនៅឯណាទេ។ dNTPs (A, T, C, និង G) គឺជាប្លុកសំណង់ឆៅដែលអង់ស៊ីមប្រើដើម្បីបង្កើតខ្សែសង្វាក់ DNA ថ្មី។

សារៈសំខាន់ស្មើគ្នាគឺបរិយាកាសដែលប្រតិកម្មកើតឡើង។ សតិបណ្ដោះអាសន្នផ្តល់នូវបរិយាកាសគីមីមានស្ថេរភាព ជាពិសេសផ្តោតលើ pH និងការប្រមូលផ្តុំនៃអ៊ីយ៉ុងម៉ាញេស្យូម ដែលជា cofactors សំខាន់សម្រាប់អង់ស៊ីម DNA polymerase ។ ជាចុងក្រោយ ការប្រតិបត្តិប្រតិកម្មរាងកាយទាមទារម៉ាស៊ីនកំដៅដែលមានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ ដែលជារឿយៗគេហៅថា ម៉ាស៊ីន PCR ដែលគ្រប់គ្រងយ៉ាងជាក់លាក់នូវការផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាពយ៉ាងឆាប់រហ័សដែលត្រូវការដើម្បីបង្កឱ្យមានដំណាក់កាលនីមួយៗនៃប្រតិកម្ម។

សមាសធាតុសំខាន់ៗនៃ PCR Mix

1. គំរូ DNA ៖ គំរូដែលមានលំដាប់គោលដៅ។

2. DNA Polymerase : ជាធម្មតា Taq polymerase ដែលនៅតែសកម្មនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់។

3. Primers : ខ្សែបញ្ជូនបន្តនិងបញ្ច្រាសដែលកំណត់ព្រំដែនពង្រីក។

4. dNTPs ៖ មូលដ្ឋាន nucleotide ទាំងបួនដែលបម្រើជា 'ink' សម្រាប់ម៉ាស៊ីនថតចម្លង។

5. Buffer និង Ions ៖ រក្សាប្រសិទ្ធភាព និងស្ថេរភាពនៃអង់ស៊ីម។

តើ ៤ ជំហាននៃ PCR មានអ្វីខ្លះ?

ដំណើរការ PCR មានដំណាក់កាលមុខងារចម្បងចំនួនបួន៖ ការចាប់ផ្តើម ការប្រែពណ៌ ការបន្ទោរបង់ និងការពង្រីក (ត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា ការពន្លូត)។

ដំណាក់កាលដំបូង ការចាប់ផ្តើម គឺជាព្រឹត្តិការណ៍តែម្តង ដែលអង្គជំនុំជម្រះប្រតិកម្មត្រូវបានកំដៅដល់សីតុណ្ហភាពខ្ពស់ ដើម្បីធានាថា DNA polymerase ត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មពេញលេញ ហើយសារធាតុកខ្វក់ណាមួយត្រូវបានបន្សាប។ បន្ទាប់ពីនេះ វដ្តនៃ Denaturation ចាប់ផ្តើម ដែល DNA ពីរខ្សែត្រូវបានបំបែក។ នេះត្រូវបានបន្តដោយ Annealing ដែល primers ស្វែងរកគោលដៅរបស់ពួកគេ ហើយចុងក្រោយ Extension ដែល DNA ថ្មីត្រូវបានសំយោគ។ វដ្តបីដំណាក់កាលនេះ (Denaturation, Annealing, Extension) ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពី 25 ទៅ 40 ដង។

ដោយសារតែបរិមាណ DNA កើនឡើងទ្វេដងជាមួយនឹងគ្រប់វដ្តជោគជ័យ នោះការលូតលាស់គឺអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល។ ឧទាហរណ៍ បន្ទាប់ពី 30 វដ្ត ម៉ូលេគុល DNA តែមួយអាចប្រែទៅជាជាងមួយពាន់លានច្បាប់ចម្លង។ ប្រសិទ្ធភាពនេះគឺជាអ្វីដែលបង្កើត ម៉ាស៊ីនកំដៅក្នុងបន្ទប់ពិសោធន៍ទំនើប មានសារៈសំខាន់ណាស់សម្រាប់វិទ្យាសាស្ត្រទំនើប។ ប្រសិនបើគ្មានដុំកំដៅ និងម៉ាស៊ីនត្រជាក់ដែលមានល្បឿនលឿនដែលរកឃើញនៅក្នុង ម៉ាស៊ីន PCR ដែល មានគុណភាពខ្ពស់ នោះ ដំណើរការនឹងយឺតពេកសម្រាប់ការប្រើប្រាស់ជាក់ស្តែងនៅក្នុងបរិយាកាសវិនិច្ឆ័យដែលដំណើរការខ្ពស់។

តើជំហានម៉ាស៊ីន PCR មានអ្វីខ្លះ?

ជំហានម៉ាស៊ីន PCR ពាក់ព័ន្ធនឹងការជិះកង់ដោយស្វ័យប្រវត្តិនៃសីតុណ្ហភាពតាមរយៈការគ្រប់គ្រងអេឡិចត្រូនិចច្បាស់លាស់នៃប្លុកកម្ដៅ ការគ្រប់គ្រងអត្រានៃការឡើងភ្នំ ពេលវេលាកាន់ និងការធ្វើឱ្យត្រជាក់ចុងក្រោយ។

ម៉ាស៊ីន PCR ដំណើរការដោយប្រើប្រាស់ធាតុ Peltier ដើម្បីកំដៅ និងត្រជាក់យ៉ាងលឿននូវប្លុកដែកដែលផ្ទុកបំពង់ប្រតិកម្ម។ 'ជំហាន' តាមទស្សនៈរបស់ម៉ាស៊ីនរួមមាន 'Ramp' ដែលជាល្បឿនផ្លាស់ប្តូររវាងសីតុណ្ហភាព និង 'សង្កត់' ដែលជារយៈពេលដែលម៉ាស៊ីនរក្សាសីតុណ្ហភាពជាក់លាក់។ ម៉ាស៊ីនកម្រិតខ្ពស់ត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីឱ្យមានអត្រាកើនឡើងលឿនបំផុត ដើម្បីកាត់បន្ថយពេលវេលាដែលបានចំណាយក្នុងការផ្លាស់ប្តូរ ដែលកាត់បន្ថយហានិភ័យនៃការចងមិនជាក់លាក់ ឬការថយចុះនៃអង់ស៊ីម។

កម្មវិធីនៅក្នុងម៉ាស៊ីនអនុញ្ញាតឱ្យអ្នកប្រើសរសេរពិធីការស្មុគស្មាញ។ នេះរួមបញ្ចូលទាំងការឡើងកំដៅដំបូង រង្វិលជុំដដែលៗនៃដំណាក់កាលសំខាន់ទាំងបី និងជំហានចុងក្រោយនៅសីតុណ្ហភាពត្រជាក់ (ជាធម្មតា 4°C) ដើម្បីរក្សាសំណាករហូតដល់អ្នកបច្ចេកទេសអាចទាញយកវាបាន។ ចំណុចប្រទាក់ឌីជីថលទំនើបនៅលើ ម៉ាស៊ីន PCR ក៏អនុញ្ញាតឱ្យមានការត្រួតពិនិត្យពេលវេលាជាក់ស្តែងនៃប្រតិកម្មផងដែរ ដោយធានាថាទម្រង់កម្ដៅកំពុងត្រូវបានអនុវត្តយ៉ាងពិតប្រាកដដូចកម្មវិធីដែលបានកំណត់សម្រាប់ការផលិតឡើងវិញអតិបរមា។

តើសីតុណ្ហភាពដែលប្រើសម្រាប់ជំហាន denature គឺជាអ្វី?

ជំហាន denaturation ជាធម្មតាប្រើប្រាស់សីតុណ្ហភាពចន្លោះពី 94°C និង 98°C ដើម្បីជួយសម្រួលដល់ការបំបែកចំណងអ៊ីដ្រូសែនរវាងខ្សែ DNA។

នៅកំដៅខ្លាំងនេះ រចនាសម្ព័ន្ធទ្វេ-helix នៃ DNA មិនស្ថិតស្ថេរ។ ចំណងអ៊ីដ្រូសែនដែលកាន់គូ adenine-thymine និង cytosine-guanine ជាមួយគ្នារលាយបាត់ បណ្តាលឱ្យមានខ្សែ DNA ឯករាជ្យពីរ។ នេះគឺជាតម្រូវការជាមុនដ៏សំខាន់សម្រាប់ជំហានបន្ទាប់ ដោយសារសារធាតុ primers និងអង់ស៊ីម DNA polymerase អាចធ្វើអន្តរកម្មជាមួយគំរូដែលមានខ្សែតែមួយប៉ុណ្ណោះ។ ប្រសិនបើសីតុណ្ហភាពទាបពេក DNA នឹងមិនអាចបំបែកបានទាំងស្រុង ដែលនាំទៅដល់ការពង្រីកដែលបរាជ័យ ឬគ្មានប្រសិទ្ធភាព។

ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការរក្សាសីតុណ្ហភាពនេះតម្រូវឱ្យមាន DNA polymerase ដ៏រឹងមាំបំផុត។ នេះ​ជា​មូលហេតុ​ដែល​ការ​រក​ឃើញ​សារធាតុ Taq polymerase ដែល​នៅ​ដាច់​ឆ្ងាយ​ពី​បាក់តេរី Thermus aquaticus គឺ​មាន​បដិវត្តន៍​ខ្លាំង​ណាស់។ អង់ស៊ីមស្តង់ដារនឹងត្រូវបានបំផ្លាញនៅ 95 ° C ប៉ុន្តែ Taq នៅតែមានមុខងារ។ មន្ទីរពិសោធន៍ត្រូវតែធានាថា ម៉ាស៊ីន PCR របស់ពួកគេ ផ្តល់នូវកំដៅឯកសណ្ឋាននៅទូទាំងអណ្តូងទាំងអស់ដើម្បីការពារ 'ចំណុចត្រជាក់' ដែលការប្រែពណ៌អាចនឹងបរាជ័យ ដែលជាលក្ខណៈសំខាន់នៃ ឧបករណ៍ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុលដែលមានគុណភាពខ្ពស់។.

តើមានអ្វីកើតឡើងក្នុងអំឡុងពេលជំហាន annealing នៃ PCR?

ក្នុងអំឡុងពេលនៃជំហាន annealing សីតុណ្ហភាពត្រូវបានបន្ទាបមកនៅចន្លោះពី 50°C និង 65°C ដែលអនុញ្ញាតឱ្យ DNA primers ភ្ជាប់ជាមួយនឹងលំដាប់បន្ថែមរបស់ពួកគេនៅលើគំរូ DNA ដែលមានខ្សែតែមួយ។

ជំហាននេះគឺជាផ្នែកដ៏រសើបបំផុតនៃដំណើរការ PCR ។ សីតុណ្ហភាពជាក់លាក់ដែលបានប្រើគឺអាស្រ័យលើសីតុណ្ហភាពរលាយ (Tm) នៃ primers ដែលត្រូវបានប្រើ។ ប្រសិនបើសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ពេក primers នឹងមិនភ្ជាប់ទៅនឹងគំរូទេ។ ប្រសិនបើវាទាបពេក សារធាតុ primers អាចនឹងភ្ជាប់ទៅនឹងលំដាប់ដែលស្រដៀងនឹង 'partially' ដែលនាំទៅដល់ការពង្រីកមិនជាក់លាក់ និងលទ្ធផលរញ៉េរញ៉ៃ។ ម៉ាស៊ីន PCR ត្រូវតែអាចវាយលុកសីតុណ្ហភាពគោលដៅនេះជាមួយនឹងកម្រិតខ្ពស់នៃភាពត្រឹមត្រូវ (ជាញឹកញាប់នៅក្នុង 0.1 ° C) ។

រយៈពេលនៃជំហាន annealing ជាធម្មតាគឺ 20 ទៅ 40 វិនាទី។ ក្នុងអំឡុងពេលបង្អួចខ្លីនេះ សារធាតុ primers រុករកល្បាយប្រតិកម្មតាមរយៈចលនាម៉ូលេគុល ហើយខ្ទាស់ទៅលើទីតាំងគោលដៅ។ នៅពេលដែល primers បាន annealed ពួកគេផ្តល់នូវចំណុចចាប់ផ្តើមសម្រាប់ DNA polymerase ដើម្បីចាប់ផ្តើមបន្ថែម nucleotides ។ ការសម្របសម្រួលដ៏ជាក់លាក់នេះគឺជាអ្វីដែលអនុញ្ញាតឱ្យរកឃើញការផ្លាស់ប្តូរហ្សែនជាក់លាក់ ឬភ្នាក់ងារបង្កជំងឺនៅក្នុងគំរូជីវសាស្រ្តដ៏ស្មុគស្មាញ ដែលធ្វើឱ្យ ការវិនិយោគលើម៉ាស៊ីនវិនិច្ឆ័យប្រកបដោយវិជ្ជាជីវៈ ជាអាទិភាពសម្រាប់មន្ទីរពិសោធន៍គ្លីនិក។

តើសីតុណ្ហភាពដែលប្រើសម្រាប់ជំហានបន្ថែមគឺជាអ្វី?

ជំហានបន្ថែមត្រូវបានអនុវត្តជាទូទៅនៅ 72 ° C ដែលជាសីតុណ្ហភាពមុខងារល្អបំផុតសម្រាប់ DNA polymerase ដែលមានស្ថេរភាពកំដៅដើម្បីសំយោគខ្សែ DNA ថ្មី។

នៅសីតុណ្ហភាព 72 អង្សាសេ អង់ស៊ីម DNA polymerase ស្ថិតក្នុងប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់បំផុត។ វាចាប់ផ្តើមពីគេហទំព័របឋម ហើយចាប់ផ្តើមបន្ថែម dNTPs ទៅចុង 3' នៃ primer ដោយផ្លាស់ទីតាមខ្សែគំរូ។ អង់ស៊ីម 'អាន' គំរូ និងដាក់មូលដ្ឋានបំពេញបន្ថែមនៅក្នុងខ្សែថ្មី។ ឧទាហរណ៍ ប្រសិនបើគំរូមានអាឌីនីន ប៉ូលីមែរសេនបន្ថែម ធីមីន។ ល្បឿននៃប្រតិកម្មនេះគឺគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍; Taq polymerase អាច​បន្ថែម​ប្រហែល 1,000 គូគោល​ក្នុង​មួយ​នាទី។

រយៈពេលនៃជំហាននេះអាស្រ័យលើប្រវែងនៃផ្នែក DNA ដែលត្រូវបានចម្លង។ ប្រសិនបើលំដាប់គោលដៅមានប្រវែង 1,000 គូមូលដ្ឋាន ជំហានបន្ថែមអាចត្រូវបានកំណត់សម្រាប់មួយនាទី។ ប្រសិនបើគោលដៅខ្លីជាងនេះ ពេលវេលាអាចត្រូវបានកាត់បន្ថយ ដើម្បីសន្សំពេលវេលាដំណើរការទាំងមូល។ ការធានាឱ្យ ម៉ាស៊ីន PCR រក្សាស្ថិរភាព 72°C ពេញមួយដំណាក់កាលនេះគឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការបញ្ចប់នៃខ្សែ DNA ដែលមានប្រវែងពេញ។

តើលំហូរសីតុណ្ហភាព PCR គឺជាអ្វី?

លំហូរសីតុណ្ហភាព PCR អនុវត្តតាមវដ្ដដដែលៗនៃការឡើងកំដៅខ្លាំង ការបន្ទោរបង់កំដៅទាប និងការបន្ថែមកំដៅកម្រិតមធ្យម ដោយបង្កើតទម្រង់កម្ដៅ ' sawtooth' ។

លំហូរនេះត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីបង្កើនដំណើរការធរណីមាត្រនៃបរិមាណ DNA ។ នៅក្នុងដំណើរការធម្មតា ម៉ាស៊ីនចាប់ផ្តើមនៅសីតុណ្ហភាព 95°C រយៈពេល 2 នាទី (Initial Denaturation) បន្ទាប់មកចូលទៅក្នុងរង្វិលជុំ: 95°C រយៈពេល 30 វិនាទី 55°C រយៈពេល 30 វិនាទី និង 72°C រយៈពេល 60 វិនាទី។ រង្វិលជុំនេះធ្វើម្តងទៀត 30 ដង។ ទីបំផុត មាន 'ផ្នែកបន្ថែមចុងក្រោយ' នៅសីតុណ្ហភាព 72°C សម្រាប់រយៈពេល 5-10 នាទី ដើម្បីធានាថា DNA ខ្សែតែមួយទាំងអស់ត្រូវបានខ្សែពីរដងយ៉ាងពេញលេញ មុនពេលម៉ាស៊ីនត្រជាក់ដល់ 4°C សម្រាប់ការផ្ទុក។

ភាពជាក់លាក់នៃលំហូរសីតុណ្ហភាពនេះប៉ះពាល់ដោយផ្ទាល់ដល់ទិន្នផល និងភាពបរិសុទ្ធនៃផលិតផល PCR ។ ប្រសិនបើលំហូរមិនស៊ីសង្វាក់គ្នា អង់ស៊ីមអាចបាត់បង់សកម្មភាព ឬសារធាតុ primers អាចបង្កើត 'primer dimers' ដែលជាវត្ថុបុរាណគ្មានប្រយោជន៍នៃប្រតិកម្ម។ ដោយសារតែនេះ ការក្រិតតាមខ្នាត និងឯកសណ្ឋានកម្ដៅនៃ ម៉ាស៊ីន PCR គឺជាកត្តាសំខាន់បំផុតសម្រាប់មន្ទីរពិសោធន៍ដែលធ្វើការវិនិច្ឆ័យ ឬស្រាវជ្រាវម៉ូលេគុល។

តារាងសង្ខេបនៃលំហូរសីតុណ្ហភាព

ដំណាក់កាល	សីតុណ្ហភាពធម្មតា។	គោលបំណង
ការចាប់ផ្តើម	94°C – 96°C	ធ្វើឱ្យអង់ស៊ីមសកម្ម បង្កើត DNA ស្មុគស្មាញ។
ការប្រែពណ៌	94°C – 98°C	បំបែក DNA ពីរខ្សែទៅជាខ្សែតែមួយ។
ការស្រើបស្រាល	50 ° C - 65 ° C	អនុញ្ញាតឱ្យ primers ចងទៅនឹងលំដាប់គោលដៅ។
ផ្នែកបន្ថែម	៧២ អង្សាសេ	DNA polymerase សំយោគខ្សែ DNA ថ្មី។
ការសង្កត់ចុងក្រោយ	4°C – 10°C	ការផ្ទុករយៈពេលខ្លីនៃផលិតផលពង្រីក។

សេចក្តីសន្និដ្ឋាន

ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ Polymerase គឺជាឧបករណ៍ដ៏ឆើតឆាយ និងមានឥទ្ធិពល ដែលបានធ្វើបដិវត្តន៍ទេសភាពនៃវិទ្យាសាស្ត្រជីវសាស្រ្ត។ ដោយធ្វើតាមជំហានដ៏ល្អិតល្អន់នៃ denaturation, annealing និង extension អ្នកវិទ្យាសាស្ត្រអាចដោះសោអាថ៌កំបាំងដែលមាននៅក្នុង DNA ដោយផ្តល់ចម្លើយចំពោះសំណួរវេជ្ជសាស្ត្រ និងកោសល្យវិច្ច័យដ៏ស្មុគស្មាញ។ ភាពជោគជ័យនៃដំណើរការនេះគឺពឹងផ្អែកយ៉ាងខ្លាំងទៅលើគុណភាពនៃសារធាតុ reagents និងភាពជាក់លាក់នៃ ម៉ាស៊ីន PCR ដែលប្រើដើម្បីប្រតិបត្តិវដ្តកម្ដៅ។

សម្រាប់មន្ទីរពិសោធន៍ណាមួយដែលចង់សម្រេចបានលទ្ធផលជាប់លាប់ និងអាចទុកចិត្តបាន ការយល់ដឹងអំពីភាពខុសប្លែកគ្នានៃការគ្រប់គ្រងសីតុណ្ហភាព និងការគ្រប់គ្រងវដ្តគឺចាំបាច់ណាស់។ មិនថាអ្នកកំពុងធ្វើការស្រាវជ្រាវជាមូលដ្ឋាន ឬការវិនិច្ឆ័យរោគក្នុងកម្រិតសំឡេងខ្ពស់នោះទេ ជម្រើសនៃឧបករណ៍ និងការប្រកាន់ខ្ជាប់នូវពិធីការដែលបានកែលម្អនឹងកំណត់ភាពត្រឹមត្រូវនៃការងាររបស់អ្នក។ សម្រាប់អ្នកដែលចាប់អារម្មណ៍ផ្នែកខាងភស្តុភារនៃការបង្កើតមន្ទីរពិសោធន៍ម៉ូលេគុល សូមស្វែងយល់ពី ការចំណាយ និងលក្ខណៈបច្ចេកទេសនៃប្រព័ន្ធ PCR ទំនើប គឺជាជំហានឡូជីខលបន្ទាប់ក្នុងការជំរុញសមត្ថភាពវិនិច្ឆ័យរបស់អ្នក។