Реаксияи занҷири полимеразӣ, ки ба таври васеъ ҳамчун PCR маъруф аст, яке аз дастовардҳои муҳимтарини технологӣ дар таърихи биологияи молекулавӣ мебошад. Ин усул, ки дар солҳои 1980-ум таҳия шуда буд, аз тартиби махсуси лабораторӣ ба воситаи бунёдие, ки дар ташхиси тиббӣ, илми судӣ ва тадқиқоти генетикӣ истифода мешавад, гузашт. Бо ба олимон имкон дод, ки як намунаи ночизи ДНК гиранд ва онро ба миллионҳо нусха афзоиш диҳанд, PCR имкон дод, ки генҳо муфассал омӯхта шаванд, патогенҳо бо дақиқии шадид ошкор карда шаванд ва аломатҳои генетикӣ, ки қаблан ба усулҳои стандартии таҳлилӣ ноаён буданд, муайян карда шаванд.
Раванди PCR як усули лабораторӣ мебошад, ки барои сохтани нусхаҳои сершумори як сегменти мушаххаси ДНК тавассути як давраи тағирёбии ҳарорат, бо дарназардошти денатуратсия, тозакунӣ ва васеъшавӣ истифода мешавад, ки тавассути мошини махсуси ПТР ва полимеразаи устувори ДНК мусоидат мекунад.
Фаҳмидани нозукиҳои раванди PCR барои мутахассисони лабораторӣ, тадқиқотчиёни тиббӣ ва истеҳсолкунандагони саноатӣ, ки бо таҷҳизоти ташхисӣ машғуланд, муҳим аст. Азбаски талабот ба озмоиши зуд ва дақиқи молекулавӣ дар саросари ҷаҳон афзоиш меёбад, эътимоднокии он Мошини PCR санги асосии натиҷаҳои бомуваффақияти лабораторӣ мегардад. Ин мақола дастури мукаммалро оид ба марҳилаҳо, ҳароратҳо ва талаботи механикии раванди PCR барои таъмини амплификацияи баландсифати ДНК ва натиҷаҳои устувори таҷрибавӣ пешниҳод мекунад.
Ҷадвали мухтасари мақола
| Ҷудокунӣ |
Хулоса |
| PCR чист? |
PCR як усули биологияи молекулавӣ мебошад, ки барои ба таври экспоненсиалӣ афзоиш додани пайдарпаии мушаххаси ДНК барои барномаҳои гуногуни поёноб истифода мешавад. |
| Барои PCR чӣ лозим аст? |
ПЗР бомуваффақият як қолаби ДНК, праймерҳо, нуклеотидҳо, полимеразаи устувори ДНК ва циклери гармии дақиқи баландро талаб мекунад. |
| 4 марҳилаи PCR кадомҳоянд? |
Ин раванд пайдарпайии мантиқии инициализатсия, денатуратсия, тозакунӣ ва васеъшавӣ барои дучанд кардани мундариҷаи ДНК дар ҳар як давраро пайгирӣ мекунад. |
| Қадамҳои мошини PCR кадомҳоянд? |
Таҷҳизот гузариши дақиқи ҳароратро автоматӣ карда, кафолат медиҳад, ки реаксияҳои биохимиявӣ дар фосилаҳои дақиқи зарурӣ ба амал меоянд. |
| Ҳарорат барои қадами денатура истифода мешавад? |
Ҳарорати баланд, маъмулан аз 94 ° C то 98 ° C барои шикастани пайвандҳои гидроген ва ҷудо кардани ДНК-и дуқабата истифода мешавад. |
| Ҳангоми марҳилаи пошидан чӣ мешавад? |
Дар ин марҳила, ҳарорат паст карда мешавад, то ба праймерҳо имкон диҳанд, ки ба пайдарпаии ҳадафҳои иловагии онҳо дар ДНК-и якқатор пайваст шаванд. |
| Ҳарорат барои қадами дарозкунӣ чӣ гуна аст? |
Ин марҳила одатан дар 72 ° C рух медиҳад, ҳарорати оптималии Taq полимераз барои синтез кардани риштаи нави ДНК. |
| Ҷараёни ҳарорати PCR чӣ гуна аст? |
Ҷараён шакли гардиши босуръати ҳарорати баланд, паст ва миёнаро дар бар мегирад, ки то расидан ба консентратсияи дилхоҳ такрор мешаванд. |
PCR чист?
PCR ё реаксияи занҷири полимеразӣ як усули табдилдиҳандаи биологияи молекулавӣ мебошад, ки барои тавлиди босуръати миллионҳо то миллиардҳо нусхаҳои намунаи мушаххаси ДНК пешбинӣ шудааст.
Дар асл, ПТР ҳамчун 'нусхаи биологӣ' амал мекунад. Пеш аз ихтироъ, тақвият додани ДНК як раванди суст ва душворе буд, ки клонкунии ДНК ба бактерияҳоро дар бар мегирад. Бо пайдоиши Мошини PCR , муҳаққиқон ҳоло метавонанд як ген ё сегменти мушаххаси геномро ҷудо кунанд ва онро дар тӯли чанд соат афзоиш диҳанд. Ин қобилият ҳаётан муҳим аст, зеро аксари таҳлилҳои биохимиявӣ миқдори зиёди ДНК-ро талаб мекунанд, то сигнали ченшаванда ба даст оранд ва намунаҳои табиӣ аксар вақт танҳо миқдори микроэлементҳоро таъмин мекунанд.
Гуногунии ин технология дар доираи гуногуни татбиқи он дар соҳаҳои гуногун инъикос меёбад. Дар танзимоти клиникӣ, он барои муайян кардани сарбории вирусӣ, ба монанди санҷиши COVID-19 ё ВИЧ истифода мешавад. Дар экспертизаи криминалистӣ он ба муфаттишон имкон медиҳад, ки шахсони алоҳидаро аз намунаҳои микроскопии маводи биологӣ муайян кунанд. Дар соҳаи саноат ПТР тозагии маҳсулоти хӯрокворӣ ва ошкор кардани организмҳои аз ҷиҳати генетикӣ тағйирёфтаро таъмин мекунад. Фаҳмидани принсипҳо ва хароҷоти технологияи PCR барои лабораторияҳое, ки мехоҳанд қобилияти ташхиси худро такмил диҳанд, муҳим аст.
Барои PCR чӣ лозим аст?
Реаксияи бомуваффақияти ПТР панҷ ҷузъи асосиро талаб мекунад: қолаби ДНК, праймерҳои мушаххас, трифосфатҳои дезоксинуклеотидҳо (dNTPs), полимерази ДНК-и ба гармӣ устувор (ба монанди Taq) ва маҳлули махсуси буферӣ.
Шаблони ДНК ҳамчун нақшаи аслӣ, ки шумо мехоҳед нусхабардорӣ кунед, хизмат мекунад. Праймерҳо қисмҳои кӯтоҳи синтетикии ДНК мебошанд, ки барои мувофиқат ба аввал ва охири пайдарпайии мақсаднок тарҳрезӣ шудаанд. Бе инҳо, полимеразаи ДНК намедонад, ки ба сохтани риштаи нав дар куҷо оғоз кунад. dNTPs (A, T, C ва G) блокҳои хоми сохтмонӣ мебошанд, ки фермент барои сохтани занҷири нави ДНК истифода мебарад.
Муҳитест, ки дар он реаксия ба амал меояд. Буфер муҳити устувори кимиёвиро таъмин мекунад, махсусан ба рН ва консентратсияи ионҳои магний, ки кофакторҳои муҳими ферментҳои полимеразаи ДНК мебошанд. Ниҳоят, иҷрои физикии реаксия як сикли гармидиҳии баландсифатро талаб мекунад, ки онро одатан мошини PCR меноманд , ки тағироти босуръати ҳароратро барои оғоз кардани ҳар як марҳилаи реаксия дақиқ назорат мекунад.
Унсурҳои асосии омехтаи PCR
Шаблон ДНК : Намунае, ки пайдарпаии ҳадафро дар бар мегирад.
ДНК Полимераза : Одатан Так полимераз, ки дар ҳарорати баланд фаъол боқӣ мемонад.
Примерҳо : риштаҳои пеш ва баръакс, ки сарҳадҳои пурқувватро муайян мекунанд.
dNTPs : Чор асоси нуклеотид, ки ҳамчун 'сиёҳӣ' барои нусхабардорӣ хидмат мекунанд.
Буфер ва ионҳо : самаранокӣ ва устувории ферментативиро нигоҳ медорад.
4 марҳилаи PCR кадомҳоянд?
Раванди ПТР аз чор марҳилаи асосии функсионалӣ иборат аст: ибтидосозӣ, денатуратсия, тановулкунӣ ва васеъшавӣ (инчунин бо номи дарозшавӣ маълум аст).
Марҳилаи аввал, Оғозсозӣ, як ҳодисаи якдафъаина мебошад, ки дар он камераи реаксия то ҳарорати баланд гарм карда мешавад, то пурра фаъол шудани полимерази ДНК ва безараргардонии ҳама гуна ифлоскунандаҳо таъмин карда шавад. Пас аз ин, давраи денатуратсия оғоз мешавад, ки дар он ДНК-и дуқабата ҷудо мешавад. Пас аз он Annealing, ки дар он праймерҳо ҳадафҳои худро пайдо мекунанд ва ниҳоят Extension, ки дар он ДНК-и нав синтез карда мешавад. Ин давраи семарҳила (Денатуратсия, Аннаализатсия, васеъшавӣ) аз 25 то 40 маротиба такрор карда мешавад.
Азбаски миқдори ДНК бо ҳар як давраи муваффақ дучанд мешавад, афзоиш экспоненсиалӣ аст. Масалан, пас аз 30 давра, як молекулаи ДНК метавонад ба зиёда аз як миллиард нусха табдил ёбад. Ин самаранокии он чизест циклҳои гармидиҳии муосири лабораторӣ барои илми муосир хеле муҳим аст. Бе блокҳои гармидиҳӣ ва хунуккунии баландсуръат, ки дар як мошини баландсифати PCR пайдо мешаванд , ин раванд барои истифодаи амалӣ дар муҳити ташхисии сермахсул хеле суст хоҳад буд.
Қадамҳои мошини PCR кадомҳоянд?
Қадамҳои мошини PCR гардиши автоматии ҳароратро тавассути назорати дақиқи электронии блоки гармӣ, идоракунии суръати рампа, вақти нигоҳдорӣ ва сардшавии ниҳоӣ дар бар мегирад.
Мошини PCR бо истифода аз унсурҳои Пелтиер барои зуд гарм кардан ва хунук кардани блоки металлӣ, ки қубурҳои реаксияро нигоҳ медорад, кор мекунад. 'Қадамҳо' аз нуқтаи назари мошин иборатанд аз 'Рампа', ки суръати гузариш байни ҳароратҳо мебошад ва 'Нигоҳдорӣ', ки давомнокии ҳарорати муайяни мошинро нигоҳ медорад. Мошинҳои олӣ тарҳрезӣ шудаанд, ки суръати хеле зудро дошта бошанд, то вақти дар давраи гузариш сарфшударо кам кунанд, ки хатари пайвастшавии ғайримуқаррарӣ ё таназзули ферментҳоро коҳиш медиҳад.
Нармафзори дохили мошин ба корбарон имкон медиҳад, ки протоколҳои мураккабро барномарезӣ кунанд. Ин гармкунии ибтидоӣ, ҳалқаҳои такрории се марҳилаи асосӣ ва қадами ниҳоии нигоҳдорӣ дар ҳарорати хунук (одатан 4°C) барои нигоҳ доштани намунаҳо то он даме, ки техник онҳоро гирифта натавонад, дар бар мегирад. Интерфейсҳои муосири рақамӣ дар мошини PCR инчунин имкон медиҳанд, ки реаксияро дар вақти воқеӣ назорат кунанд ва кафолат диҳанд, ки профили гармидиҳӣ маҳз ҳамон тавре ки барои такрористеҳсоли ҳадди аксар барномарезӣ шудааст, риоя карда мешавад.
Ҳарорат барои қадами денатура истифода мешавад?
Марҳилаи денатуратсия одатан ҳарорати байни 94 ° C ва 98 ° C барои осон кардани шикастани пайвандҳои гидрогенӣ байни риштаҳои ДНК истифода мешавад.
Дар ин гармии шадид сохтори дугонаи ДНК ноустувор мегардад. Пайвандҳои гидроген, ки ҷуфтҳои аденин-тимин ва ситозин-гуанинро якҷоя нигоҳ медоранд, об мешаванд ва дар натиҷа ду риштаи ягонаи мустақили ДНК ба вуҷуд меоянд. Ин як шарти муҳим барои қадамҳои оянда аст, зеро праймерҳо ва ферментҳои полимеразаи ДНК танҳо бо қолабҳои якқатор ҳамкорӣ карда метавонанд. Агар ҳарорат хеле паст бошад, ДНК пурра ҷудо намешавад, ки ба пурқувваткунии ноком ё бесамар оварда мерасонад.
Аммо, нигоҳ доштани ин ҳарорат як полимеразаи хеле мустаҳками ДНК-ро талаб мекунад. Ин аст, ки кашфи полимерази Так, ки аз бактерияи гармидуст Thermus aquaticus ҷудо карда шудааст , инқилобӣ буд. Ферментҳои стандартӣ дар ҳарорати 95 ° C нобуд мешаванд, аммо Taq функсионалӣ боқӣ мемонад. Лабораторияҳо бояд мошини ПТР-и худро дар тамоми чоҳҳо гармидиҳии якхела таъмин кунанд, то 'нуқтаҳои сард' -ро пешгирӣ кунанд, ки дар он ҷо денатуратсия ноком мешавад, ки ин хусусияти асосии тачхизоти аълосифати биологияи молекулавй.
Ҳангоми марҳилаи тозакунии PCR чӣ рӯй медиҳад?
Дар давоми марҳилаи тозакунӣ, ҳарорат то аз 50 ° C то 65 ° C паст карда мешавад, ки ба праймерҳои ДНК имкон медиҳанд, ки ба пайдарпаии иловагии худ дар қолибҳои якқатораи ДНК пайваст шаванд.
Ин қадам эҳтимолан қисми ҳассостарин раванди PCR мебошад. Ҳарорати мушаххаси истифодашуда аз ҳарорати обшавии (Tm) аз праймерҳои истифодашаванда вобаста аст. Агар ҳарорат хеле баланд бошад, праймерҳо ба қолаб пайваст намешаванд. Агар он хеле паст бошад, праймерҳо метавонанд ба пайдарпайҳое, ки танҳо 'қисман' монанданд, пайваст шуда, ба пурқувваткунии ғайримуқаррарӣ ва натиҷаҳои бесарусомон оварда мерасонанд. Мошини PCR бояд қодир бошад, ки ин ҳарорати мақсаднокро бо дараҷаи баланди дақиқ (аксар вақт дар ҳудуди 0,1 ° C) занад.
Давомнокии марҳилаи тозакунӣ одатан аз 20 то 40 сония аст. Дар давоми ин равзанаи мухтасар, праймерҳо омехтаи реаксияро тавассути ҳаракати молекулавӣ паймоиш мекунанд ва ба макони мақсаднок мепайванданд. Вақте ки праймерҳо тоза карда мешаванд, онҳо нуқтаи ибтидоиро барои полимеразаи ДНК барои оғоз кардани илова кардани нуклеотидҳо фароҳам меоранд. Ин ҳамоҳангсозии дақиқ он чизест, ки имкон медиҳад, ки мутатсияҳои мушаххаси генетикӣ ё патогенҳо дар намунаи мураккаби биологӣ муайян карда шавад. сармоягузорӣ ба мошинҳои ташхисии касбӣ афзалият барои лабораторияҳои клиникӣ.
Ҳарорат барои қадами дарозкунӣ чӣ гуна аст?
Қадами васеъкунӣ одатан дар 72 ° C иҷро карда мешавад, ки ин ҳарорати оптималии функсионалии полимеразаи ба гармии устувори ДНК барои синтез кардани риштаи нави ДНК мебошад.
Дар ҳарорати 72°С, ферменти полимерази ДНК дар баландтарин самаранокии худ аст. Он аз макони праймер оғоз мешавад ва илова кардани dNTP-ро ба 3' охири праймер оғоз мекунад ва дар қади риштаи шаблон ҳаракат мекунад. Фермент шаблонро 'мехонад' ва пойгоҳи иловагиро дар риштаи нав ҷойгир мекунад. Масалан, агар қолаб Аденин дошта бошад, полимераз як Тиминро илова мекунад. Суръати ин реаксия таъсирбахш аст; Так полимераз метавонад дар як дақиқа тақрибан 1000 ҷуфти асосиро илова кунад.
Давомнокии вақти ин қадам аз дарозии сегменти ДНК нусхабардорӣшаванда вобаста аст. Агар пайдарпаии ҳадаф 1000 ҷуфти асосӣ бошад, қадами тамдид метавонад барои як дақиқа муқаррар карда шавад. Агар ҳадаф кӯтоҳтар бошад, вақтро метавон кам кард, то вақти коркарди умумиро сарфа кунад. Таъмини мошини ПТР дар тӯли ин марҳила ҳарорати мӯътадили 72 °C барои анҷом додани риштаҳои пурраи ДНК муҳим аст.
Ҷараёни ҳарорати PCR чӣ гуна аст?
Ҷараёни ҳарорати PCR як давраи такрории денатуратсияи гармии баланд, гармшавии пасти гармӣ ва тамдиди гармии мӯътадилро пайгирӣ намуда, профили гармии 'дандони арра'-ро эҷод мекунад.
Ин ҷараён барои ба ҳадди аксар расонидани пешрафти геометрии миқдори ДНК тарҳрезӣ шудааст. Дар кори маъмулӣ, мошин дар 95 ° C барои 2 дақиқа оғоз мекунад (Денатуратсияи ибтидоӣ), сипас ба ҳалқа ворид мешавад: 95 ° C барои 30 сония, 55 ° C барои 30 сония ва 72 ° C барои 60 сония. Ин давра 30 маротиба такрор мешавад. Ниҳоят, дар ҳарорати 72°C барои 5-10 дақиқа 'Дастшавии ниҳоӣ' мавҷуд аст, то ки тамоми ДНК-и якқатор пурра дуқабата бошад, пеш аз он ки мошин то 4°C барои нигоҳдорӣ сард шавад.
Дақиқии ин ҷараёни ҳарорат бевосита ба ҳосил ва тозагии маҳсулоти PCR таъсир мерасонад. Агар ҷараён номувофиқ бошад, фермент метавонад фаъолияташро гум кунад ё праймерҳо 'димерҳои ибтидоӣ' -ро ташкил кунанд, ки аслан артефактҳои бефоидаи реаксия мебошанд. Аз ин рӯ, калибрченкунӣ ва якрангии гармии мошини PCR омилҳои муҳимтарин барои ҳама лабораторияҳое мебошанд, ки ташхиси молекулавӣ ё тадқиқотро анҷом медиҳанд.
Ҷадвали ҷамъбастии ҷараёни ҳарорат
| Марҳила |
Ҳарорати муқаррарӣ |
Мақсад |
| Интициализатсия |
94 ° C - 96 ° C |
Ферментро фаъол мекунад, ДНК-и мураккабро денатурат мекунад. |
| Денатуратсия |
94 ° C - 98 ° C |
ДНК-и дуқаторро ба риштаҳои ягона ҷудо мекунад. |
| Табобат |
50 ° C - 65 ° C |
Ба праймерҳо имкон медиҳад, ки ба пайдарпаии мақсаднок пайваст шаванд. |
| Васеъ |
72°С |
ДНК полимераза риштаҳои нави ДНК-ро синтез мекунад. |
| Нигоҳдории ниҳоӣ |
4°C - 10°C |
Нигоҳдории кӯтоҳмуддати маҳсулоти пурқувватшуда. |
Хулоса
Реаксияи занҷири полимераз як воситаи шево ва пурқувватест, ки манзараи илмҳои биологияро инқилоб кардааст. Бо риояи қадамҳои дақиқи денатуратсия, тозакунӣ ва васеъшавӣ, олимон метавонанд асрори дар ДНК мавҷудбударо кушоянд ва ба саволҳои мураккаби тиббӣ ва судӣ ҷавоб диҳанд. Муваффақияти ин раванд аз бисёр ҷиҳат аз сифати реагентҳо ва дақиқии мошини PCR , ки барои иҷрои давраҳои гармидиҳӣ истифода мешавад, вобаста аст.
Барои ҳама лабораторияҳо, ки мехоҳанд ба натиҷаҳои устувор ва боэътимод ноил шаванд, фаҳмидани нозукиҳои назорати ҳарорат ва идоракунии давра муҳим аст. Новобаста аз он ки шумо тадқиқоти асосӣ ё ташхиси клиникии ҳаҷмро мегузаронед, интихоби таҷҳизот ва риояи протоколҳои оптимизатсияшуда дақиқии кори шуморо муайян мекунад. Барои онҳое, ки ба паҳлӯи логистикии ташкили лабораторияи молекулавӣ таваҷҷӯҳ доранд, омӯхтани хароҷот ва мушаххасоти техникии системаҳои муосири ПТР қадами навбатии мантиқӣ дар пешрафти қобилиятҳои ташхисии шумост.
