Ole Polymerase Chain Reaction, e ta'ua lautele ole PCR, o lo'o fa'atusalia ai se tasi o mea fa'atekonolosi sili ona taua i le tala fa'asolopito ole biology mole. Na atiaʻe i le 1980s, o lenei metotia ua suia mai se faʻataʻitaʻiga faʻapitoa falesuesue i se meafaigaluega faʻavae e faʻaaogaina i suʻesuʻega faʻafomaʻi, suʻesuʻega faʻasaienisi, ma suʻesuʻega faʻavae. E ala i le fa'atagaina o saienitisi e ave se tama'i fa'ata'ita'iga o DNA ma fa'ateleina i le faitau miliona o kopi, ua mafai ai e le PCR ona su'esu'e au'ili'ili kenera, su'esu'e fa'ama'i ma le sa'o lelei, ma fa'ailoa fa'ailoga fa'ailoga sa le'i va'aia muamua i metotia su'esu'e masani.
O le faiga o le PCR ose faiga su'esu'e e fa'aaogaina e faia ai kopi e tele o se vaega DNA fa'apitoa e ala i se taamilosaga o suiga o le vevela, e aofia ai le denaturation, fa'alumaina, ma le fa'alauteleina, fa'afaigofieina e se masini PCR fa'apitoa ma se DNA polymerase e fa'amautu vevela.
O le malamalama i le lavelave o le faiga o le PCR e manaʻomia mo tagata suʻesuʻe suʻesuʻe, fomaʻi suʻesuʻe, ma fale gaosi oloa o loʻo aʻafia i meafaigaluega faʻapitoa. A'o fa'aauau pea le fa'atupula'ia i le lalolagi atoa le mana'omia mo su'esu'ega vave ma sa'o, o le fa'atuatuaina o le Ua avea le masini PCR ma maatulimanu o taunu'uga manuia su'esu'e. O lenei tusiga o loʻo tuʻuina atu ai se taʻiala atoatoa i laasaga, vevela, ma manaʻoga faʻainisinia o le faʻagasologa o le PCR e faʻamautinoa ai le faʻalauteleina o le DNA ma le malosi o faʻataʻitaʻiga.
Laupapa Aotelega o Mataupu
| Vaega |
Aotelega |
| O le a le PCR? |
O le PCR ose molecular biology technique e fa'aaogaina e fa'ateleina ai fa'asologa o DNA mo fa'aoga eseese i lalo. |
| O le a le mea e manaʻomia mo le PCR? |
Ole PCR manuia e mana'omia ai se DNA fa'ata'ita'i, fa'amuamua, nucleotides, se DNA polymerase mautu, ma se fa'ata'avale vevela maualuga. |
| O a laasaga e 4 ole PCR? |
O le faagasologa e mulimuli i se faasologa talafeagai o le amataina, denaturation, annealing, ma le faʻalauteleina e faʻaluaina le DNA anotusi taʻamilosaga taʻitasi. |
| O a laasaga o masini PCR? |
O mea faigaluega e fa'autometi suiga sa'o o le vevela, fa'amautinoa e tutupu fa'agaioiga fa'aolaola i taimi sa'o mana'omia. |
| O le a le vevela o loʻo faʻaaogaina mo le denature step? |
O le vevela maualuga, e masani lava i le va o le 94°C ma le 98°C, e faʻaaogaina e motusia ai fusi o le hydrogen ma vavae ese ai le DNA faʻalua. |
| O le a le mea e tupu i le taimi o le faʻamaʻi? |
I le taimi lea, e fa'aitiitia le vevela ina ia fa'ataga ai mea fa'amuamua e fa'apipi'i fa'apitoa i a latou fa'asologa fa'atatau i le DNA e tasi. |
| O le a le vevela o loʻo faʻaaogaina mo le faʻaopoopoga laasaga? |
O lenei laasaga e masani ona tupu i le 72 ° C, o le vevela sili ona lelei mo le Taq polymerase e faʻapipiʻi ai se fusi DNA fou. |
| O le a le tafe o le vevela o le PCR? |
O le tafe e aofia ai se mamanu uila vave o le maualuga, maualalo, ma le vaeluagalemu vevela e toe fai seia oʻo i le faʻatonuga manaʻomia. |
O le a le PCR?
O le PCR, po'o le Polymerase Chain Reaction, o se auala fa'afouga mole mole biology ua fuafuaina e fa'avave ona maua ai le faitau miliona i le faitau piliona o kopi o se fa'ata'ita'iga DNA patino.
I lona autu, o le PCR e galue o se 'biological photocopier.' A'o le'i faia, o le fa'alauteleina o le DNA o se faiga fa'agesegese ma lavelave e aofia ai le fa'apipi'iina o le DNA i siama. Faatasi ai ma le oo mai o le PCR masini , e mafai nei e tagata suʻesuʻe ona faʻaesea se kene poʻo se vaega o le genome ma faʻalauteleina i totonu o se mataupu o itula. E taua tele lenei agava'a ona o le tele o su'esu'ega fa'aolaola e mana'omia ai se aofa'iga tele o le DNA e maua mai ai se fa'ailo fua, ma o fa'ata'ita'iga fa'anatura e masani ona maua ai na'o ni vaega.
O le agava'a o lenei tekonolosi e atagia mai i le tele o fa'aoga eseese i pisinisi eseese. I totonu o falemaʻi, e faʻaaogaina e iloa ai viral loads, pei ole suʻega ole COVID-19 poʻo le HIV. I su'esu'ega fa'afoma'i, e mafai ai e tagata su'esu'e ona fa'ailoa tagata ta'ito'atasi mai fa'ata'ita'iga ninii o mea ola. I totonu o pisinisi, PCR e faʻamautinoa le mama o meaʻai ma le suʻesuʻeina o meaola faʻasolosolo. Malamalama i le mataupu faavae ma tau o tekinolosi PCR e taua tele mo potu suʻesuʻe o loʻo vaʻavaʻai e faʻaleleia o latou gafatia faʻamaonia.
O le a le mea e manaʻomia mo le PCR?
O se tali manuia a le PCR e mana'omia ai vaega autu e lima: o le DNA template, fa'amuamua fa'apitoa, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), se DNA polymerase e mafai ona vevela (pei o Taq), ma se vaifofo fa'apitoa.
O le DNA template e fai ma ata muamua e te mana'o e kopi. Primers e pupuu, fa'apipi'i fasi DNA e fa'atatau i le amataga ma le fa'ai'uga o le fa'asologa. A aunoa ma nei mea, o le a le iloa e le DNA polymerase le mea e amata ai ona fausia le manoa fou. O le dNTPs (A, T, C, ma G) o poloka fau fale ia e faʻaogaina e le enzyme e fausia ai le filifili DNA fou.
E tutusa lava le taua o le siosiomaga lea e tupu ai le tali. O le pa'u e maua ai se si'osi'omaga kemikolo mautu, aemaise lava le taula'i i le pH ma le fa'atonuga o ion magnesium, o mea taua ia mo le DNA polymerase enzyme. Ma le mea mulimuli, o le faʻatinoga faaletino o le tali e manaʻomia ai se uila afi vevela maualuga, e masani ona taʻua o se masini PCR , lea e faʻatonutonu tonu le suiga vave o le vevela e manaʻomia e faʻaosoina ai laasaga taʻitasi o le tali.
Vaega Autu ole PCR Mix
Fa'ata'ita'iga DNA : Le fa'ata'ita'iga o lo'o iai le fa'asologa fa'asologa.
DNA Polymerase : E masani lava Taq polymerase, lea e tumau pea le malosi i le vevela maualuga.
Ulua'i : Fa'asaga i luma ma fa'afe'ai laina e fa'amalamalama ai le fa'atuputeleina o tua'oi.
dNTPs : O fa'avae nucleotide e fai ma 'ink' mo le kopi.
Buffer ma Ions : Faʻamautu le faʻaogaina o le enzymatic ma le mautu.
O a laasaga e 4 ole PCR?
O le fa'agasologa o le PCR e aofia ai vaega fa'atino autu e fa: Initialization, Denaturation, Annealing, and Extension (lea e ta'ua o Elongation).
O le laasaga muamua, Initialization, o se mea e tasi le taimi e faʻamafanafanaina ai le potu tali i se vevela maualuga e faʻamautinoa ai o le DNA polymerase o loʻo faʻagaioia atoatoa ma soʻo se mea leaga e faʻafefe. A maeʻa lenei mea, e amata le taamilosaga o le Denaturation, lea e vavae ese ai le DNA faʻalua. Ona soso'o ai lea ma le Annealing, lea e maua ai e le au fa'amuamua a latou sini, ma mulimuli ane Extension, lea e fa'apipi'i ai le DNA fou. O lenei taamilosaga e tolu-laasaga (Denaturation, Annealing, Extension) e toe fai 25 i le 40 taimi.
Ona o le aofaʻi o DNA e faʻaluaina i taʻamilosaga manuia uma, o le tuputupu aʻe e faʻateleina. Mo se faataʻitaʻiga, pe a mavae le 30 taamilosaga, e mafai ona liua se mole mole o le DNA e sili atu i le piliona kopi. O le mea lea e fai ai le lelei fa'aonaponei falesu'esu'e uila vevela e matua taua mo le faasaienisi faaonaponei. A aunoa ma poloka faʻavevela ma malulu maualuga o loʻo maua i totonu o se maualuga masini PCR , o le a faʻagesegese tele le faagasologa mo le faʻaaogaina i totonu o siosiomaga suʻesuʻe maualuga.
O a laasaga o masini PCR?
Ole la'asaga ole masini PCR e aofia ai le ta'amilosaga otometi o le vevela e ala i le fa'atonu sa'o fa'aeletonika o se poloka fa'amalo, fa'atonutonuina o le fua fa'asolosolo, taimi taofi, ma le fa'amalulu mulimuli.
O se masini PCR e galue e ala i le fa'aogaina o elemene Peltier e fa'avave fa'avevela ma fa'alili se poloka u'amea o lo'o taofia ai fa'agaau fa'agaoioiga. O le 'Laasaga' mai le va'aiga a le masini e aofia ai le 'Ramp,' o le saoasaoa lea o suiga i le va o le vevela, ma le 'Taofi,' o le umi lea e tausia ai e le masini se vevela patino. O masini pito i luga ua mamanuina ina ia vave tele fua faʻasolosolo e faʻaitiitia ai le taimi faʻaalu i le suiga, lea e faʻaitiitia ai le lamatiaga o le le faʻapitoa o le fusifusia poʻo le faʻaleagaina o le enzyme.
O le polokalame i totonu o le masini e mafai ai e tagata fa'aoga ona fa'apolokalame fa'atonuga lavelave. E aofia ai le fa'avevela muamua, o fa'agasolo fa'asolosolo o la'asaga autu e tolu, ma le la'asaga mulimuli e taofi i se vevela malulu (e masani lava 4°C) e fa'asao ai fa'ata'ita'iga se'ia mafai e le tekinisia ona toe aumai. O feso'ota'iga fa'aonaponei fa'aonaponei i luga o se masini PCR e mafai ai fo'i le mata'ituina o le tali, fa'amautinoaina o lo'o mulimulita'ia le fa'ailoga vevela e pei ona fa'apolokalameina mo le maualuga o le toe gaosia.
O le a le vevela o loʻo faʻaaogaina mo le denature step?
O le la'asaga o le denaturation e masani ona fa'aogaina ai le vevela i le va o le 94°C ma le 98°C e fa'afaigofie ai le motusia o fusi o le hydrogen i le va o manoa DNA.
I lenei vevela tele, o le fausaga lua-helix o le DNA e le mautu. O fusi o le hydrogen o loʻo taofiofia le adenine-thymine ma le cytosine-guanine faʻatasi e liusua ese, ma iʻu ai i ni laina se lua tutoatasi o le DNA. Ose mea e mana'omia muamua mo le isi laasaga, aua o mea muamua ma le DNA polymerase enzyme e mafai ona fegalegaleai ma fa'ata'ita'iga tasi. Afai e maualalo tele le vevela, o le DNA o le a le vavae ese atoatoa, e oʻo atu ai i se faʻalavelave faʻaletonu pe le lelei.
Ae ui i lea, o le faatumauina o lenei vevela e manaʻomia ai se DNA polymerase sili ona malosi. O le mafuaaga lea o le mauaina o le Taq polymerase, na vavae ese mai le siama e fiafia i le vevela Thermus aquaticus , na matua fouvale. O enzymes masani o le a faʻaumatia i le 95 ° C, ae o loʻo tumau pea Taq. E tatau i fale su'esu'e ona fa'amautinoa o lo'o tu'uina atu e le latou masini PCR le fa'avevela fa'avela uma i vaieli uma e puipuia ai 'nofoa malulu' lea e ono le mafai ai ona fa'au'uina, o se vaega taua o le tulaga maualuga mole mole biology meafaigaluega.
O le a le mea e tupu i le taimi o le la'asaga o le PCR?
I le taimi o le faʻasolosolo faʻasolosolo, o le vevela e faʻaititia i le va o le 50°C ma le 65°C, e faʻatagaina ai le DNA primers e fusifusia ia latou faʻasologa faʻatasi i luga o mamanu DNA tasi.
O lenei laasaga e mautinoa lava o le vaega sili ona maaleale o le PCR process. O le vevela fa'apitoa e fa'aaogaina e fa'atatau ile vevela liusuavai (Tm) o fa'ameamea o lo'o fa'aaogaina. Afai e maualuga tele le vevela, o le a le fusia ia mea muamua i le mamanu. Afai e maualalo tele, e mafai ona pipii fa'asologa i fa'asologa e na'o le 'vaega' tutusa, e o'o atu ai i le fa'ateleina le fa'apitoa ma fa'aletonu i'uga. le masini PCR ona lavea lenei vevela faʻatatau i se maualuga maualuga o le saʻo (masani i totonu ole 0.1°C). E tatau ona mafai e
O le umi ole la'asaga fa'amau e masani ile 20 ile 40 sekone. I lenei fa'amalama pu'upu'u, e fa'afeiloa'i ai e fa'auluuluga le fefiloi tali e ala i le gaio'i mole ma pu'e i le nofoaga fa'atatau. O le taimi lava e faʻapipiʻi ai mea muamua, latou te saunia se amataga mo le DNA polymerase e amata faʻaopoopoina nucleotides. O lenei fa'amaopoopo sa'o o le mea lea e mafai ai mo le su'esu'eina o suiga fa'apitoa po'o pathogens i totonu o se fa'ata'ita'iga fa'aola lavelave, faia ai le tupe fa'afaigaluega i masini fa'apolofesa su'esu'e ose fa'amuamua mo fale su'esu'e.
O le a le vevela o loʻo faʻaaogaina mo le faʻaopoopoga laasaga?
Ole la'asaga fa'aopoopo e masani lava ona fa'atino ile 72°C, ole vevela fa'agaioiga sili ona lelei mo le polymerase DNA e fa'amautu vevela e fa'apipi'i ai le fusi DNA fou.
I le 72 ° C, o le DNA polymerase enzyme o loʻo i lona maualuga maualuga. E amata i le nofoaga muamua ma amata fa'aopoopo dNTPs i le pito 3' o le fa'ata'ita'i, fa'agasolo i luga o le manoa mamanu. Ole enzyme 'faitau' le fa'ata'ita'iga ma tu'u le fa'avae fa'atasi i le manoa fou. Mo se faʻataʻitaʻiga, afai o le mamanu e iai se Adenine, e faʻaopoopo e le polymerase se Thymine. O le saoasaoa o lenei tali e ofoofogia; Taq polymerase e mafai ona fa'aopoopo pe tusa ma le 1,000 taitoalua fa'avae ile minute.
Ole umi ole taimi ole la'asaga lea e fa'alagolago ile umi ole vaega ole DNA o lo'o kopiina. Afai o le fa'asologa fa'asologa e 1,000 taitoalua fa'avae le umi, e mafai ona seti le la'asaga fa'aopoopo mo le minute e tasi. Afai e puupuu le sini, e mafai ona faʻaitiitia le taimi e faʻasaoina ai le taimi atoa o gaioiga. O le fa'amautinoaina o le masini PCR o lo'o tumau pea le 72°C i lenei vaega e taua tele mo le fa'amae'aina o fusi DNA atoa.
O le a le tafe o le vevela o le PCR?
O le tafe o le vevela o le PCR e mulimulita'i i le ta'amilosaga faifaipea o le denaturation o le vevela, maualalo le vevela, ma le fa'alauteleina o le vevela, ma fa'atupuina ai se fa'amatalaga vevela 'sawtooth'.
O lenei tafe ua mamanuina e faʻateleina ai le faʻasolosolo faʻasolosolo o le aofaʻi o DNA. I se tamo'e masani, e amata le masini i le 95°C mo le 2 minute (Initial Denaturation), ona ulufale lea i se matasele: 95°C mo le 30 sekone, 55°C mo le 30 sekone, ma le 72°C mo le 60 sekone. E fa'a 30 taimi e fai ai lenei fa'alavelave. Mulimuli ane, o lo'o i ai le 'Fa'aopoopo Fa'ai'u' i le 72°C mo le 5-10 minute e fa'amautinoa ai ua fa'alua uma le DNA o lo'o pipi'i tasi a'o le'i mālū le masini i le 4°C mo le teuina.
O le sa'o o le tafe o le vevela e a'afia ai le fua ma le mama o le oloa PCR. Afai e le ogatasi le tafe, e ono le toe gaioi le enzyme po'o le mea muamua e mafai ona fausia ai 'primer dimer', o mea ia e le aoga o le gaioiga. Ona o lenei mea, o le faʻavasegaina ma le tutusa o le vevela o le masini PCR o mea sili ona taua mo soʻo se fale suʻesuʻe e faia suʻesuʻega mole mole poʻo suʻesuʻega.
Aotelega Laulau o le Vevela
| Vaega |
Tempera masani |
Faamoemoega |
| Faamuamua |
94°C – 96°C |
Fa'aagaoioia le enzyme, fa'alētonu le DNA lavelave. |
| Denaturation |
94°C – 98°C |
Tu'ueseese le DNA fa'alua fa'atasi i ni manoa e tasi. |
| Fa'asusu |
50°C – 65°C |
Fa'ataga fa'amuamua e pipii i fa'asologa fa'atatau. |
| Fa'aopoopo |
72°C |
O le DNA polymerase e fa'apipi'iina ni manoa DNA fou. |
| Taofi Mulimuli |
4°C – 10°C |
teuina mo se taimi pupuu o le oloa faʻateleina. |
Fa'ai'uga
O le Polymerase Chain Reaction ose meafaigaluega mata'ina ma mamana ua suia ai le laufanua o meaola fa'asaienisi. E ala i le mulimulitaia o laasaga o le denaturation, annealing, ma le faʻalauteleina, e mafai e saienitisi ona tatalaina mea lilo o loʻo i totonu o le DNA, ma maua ai tali i fesili faʻafomaʻi ma suʻesuʻega faʻapitoa. O le manuia o lenei faagasologa e matua fa'alagolago lava i le lelei o le reagents ma le sa'o o le masini PCR na fa'aaogaina e fa'atino ai ta'amilosaga vevela.
Mo so'o se falesu'esu'e o lo'o va'ava'ai e ausia taunu'uga tumau ma fa'atuatuaina, e mana'omia le malamalama i le fa'avasegaina o le vevela ma le puleaina o le ta'amilosaga. Pe o e faia suʻesuʻega faʻavae poʻo suʻesuʻega faʻamaʻi maualuga, o le filifiliga o meafaigaluega ma le tausisia o faʻatonuga sili ona lelei o le a faʻamalamalamaina ai le saʻo o lau galuega. Mo i latou e fiafia i le itu logistical o le faʻatulagaina o se molecular lab, suʻesuʻeina le tau ma fa'amatalaga fa'atekinisi o faiga fa'aonaponei PCR o le isi la'asaga talafeagai lea i le fa'alauteleina o ou tomai fa'ata'ita'i.
