Ko te Polymerase Chain Reaction, e mohiotia ana ko PCR, e tohu ana i tetahi o nga tino pakaruhanga hangarau i roto i te hitori o te koiora ngota. I whakawhanakehia i te tekau tau atu i 1980, kua huri tenei tikanga mai i te tikanga taiwhanga motuhake ki tetahi taputapu taketake e whakamahia ana i roto i nga mahi tirotiro hauora, i te maataiiao, me te rangahau ira. Na te tuku i nga kaiputaiao ki te tango i tetahi tauira iti o te DNA me te whakanui ake ki nga miriona kape, kua taea e te PCR te ako i nga ira i roto i nga taipitopito, te kite i nga pathogens me te tino tika, me te tautuhi i nga tohu ira kaore i kitea i mua ki nga tikanga tātari paerewa.
Ko te tukanga PCR he tikanga taiwhanga e whakamahia ana ki te hanga kape maha o tetahi wahanga DNA motuhake na roto i te huringa o nga huringa o te pāmahana, e pa ana ki te denaturation, annealing, me te toronga, ka whakahaerehia e te miihini PCR motuhake me te polymerase DNA pumau-wera.
He mea nui te mohio ki nga uauatanga o te tukanga PCR mo nga tohunga taiwhanga, kairangahau rongoa, me nga kaihanga ahumahi e uru ana ki nga taputapu tātari. I te mea kei te tipu haere tonu te tono mo te whakamatautau irapoi tere me te tika puta noa i te ao, ko te pono o te Ko te miihini PCR te kohatu kokonga o nga hua taiwhanga angitu. Ka whakaratohia e tenei tuhinga he aratohu matawhānui mo nga hikoinga, te mahana, me nga whakaritenga miihini o te tukanga PCR hei whakarite i te whakakaha DNA kounga teitei me nga hua whakamatautau pakari.
Ripanga Whakarāpopototanga Tuhinga
| Wāhanga |
Whakarāpopototanga |
| He aha te PCR? |
Ko te PCR he tikanga koiora rapoi e whakamahia ana hei whakanui ake i nga raupapa DNA motuhake mo nga momo tono whakararo. |
| He aha te mea e hiahiatia ana mo te PCR? |
Ko te PCR angitu e hiahia ana ki te DNA tauira, ki te tuatahi, ki te nucleotides, ki te polymerase DNA u, me te paihikara waiariki tino tika. |
| He aha nga waahanga e 4 o te PCR? |
Ko te tukanga e whai ana i te raupapa arorau o te arawhiti, te denaturation, te annealing, me te toronga ki te whakarua i te ihirangi DNA ia huringa. |
| He aha nga hikoi miihini PCR? |
Ka whakaaunoatia e te taputapu nga huringa pāmahana tika, me te whakarite kia puta nga tauhohenga koiora i nga waa e hiahiatia ana. |
| He aha te pāmahana e whakamahia ana mo te taahiraa denature? |
Ko te pāmahana teitei, i waenga i te 94°C me te 98°C, ka whakamahia ki te wawahi i nga here hauwai me te wehe i te DNA whenu-rua. |
| He aha te mea ka tupu i te wa o te mahi annealing? |
I roto i tenei wahanga, ka whakahekehia te pāmahana kia taea ai e nga kaimatai te here motuhake ki o raatau raupapa whainga i runga i te DNA whenu kotahi. |
| He aha te pāmahana e whakamahia ana mo te taahiraa toronga? |
Ko te tikanga ka puta tenei taahiraa i te 72°C, te pāmahana tino pai mo te Taq polymerase ki te whakahiato i tetahi whenu DNA hou. |
| He aha te rere pāmahana PCR? |
Kei roto i te rere he tauira paihikara tere o te teitei, te iti, me te pāmahana waenga ka tukurua kia tae ra ano te kukū e hiahiatia ana. |
He aha te PCR?
Ko te PCR, ko te Polymerase Chain Reaction ranei, he tikanga koiora irapoi whakahuri i hangaia kia tere te whakaputa i te miriona ki te piriona kape o te tauira DNA motuhake.
I tona uho, ko te PCR te mahi hei 'whakaahua whakaahua koiora.' I mua i tana hangahanga, he puhoi me te uaua te whakakaha i te DNA he mahi puhoi me te uaua e uru ana ki te whakakao i te DNA hei huakita. I te taenga mai o te Mīhini PCR , ka taea e nga kairangahau te wehe i tetahi ira motuhake, i tetahi waahanga ranei o te ira me te whakanui ake i roto i nga haora. He mea nui tenei kaha na te mea ko te nuinga o nga tātaritanga matū koiora e hiahia ana kia nui te DNA hei whakaputa i te tohu ine, a ko te nuinga o nga tauira taiao e whakarato ana i nga moni tohu noa.
Ko te kaha o tenei hangarau ka kitea i roto i ona momo momo tono puta noa i nga umanga rereke. I roto i nga waahi haumanu, ka whakamahia ki te kite i nga uta viral, penei i te COVID-19, i te whakamatautau HIV ranei. I roto i nga mahi whakawai, ka taea e nga kaitirotiro te tautuhi i nga tangata mai i nga tauira miihini o nga rawa koiora. I roto i te rängai ahumahi, ka whakarite te PCR i te pokekore o nga hua kai me te kitenga o nga rauropi whakarereke ira. Te maarama ki te Ko nga maataapono me nga utu o te hangarau PCR he mea tino nui mo nga taiwhanga e titiro ana ki te whakapai ake i o raatau tohu tohu.
He aha te mea e hiahiatia ana mo te PCR?
Ko te tauhohenga PCR angitu e hiahia ana kia rima nga waahanga matua: te tauira DNA, nga mea tuatahi, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), he DNA polymerase-wera (penei i a Taq), me tetahi otinga parepare motuhake.
Ko te tauira DNA te mahere taketake e hiahia ana koe ki te kape. He poto, he waahanga hangahanga o te DNA kua hangaia kia rite ki te timatanga me te mutunga o te raupapa whainga. Ki te kore enei, karekau te DNA polymerase e mohio ki hea ka timata te hanga i te whenu hou. Ko nga dNTP (A, T, C, me G) nga poraka hanga mata e whakamahia ana e te enzyme hei hanga i te mekameka DNA hou.
He mea nui ano te taiao e puta ai te tauhohenga. Ka whakaratohia e te kaitarai he taiao matū pumau, me te aro nui ki te pH me te kukū o nga katote konupora, he mea tino nui mo te DNA polymerase enzyme. Ka mutu, ko te mahi-a-tinana o te tauhohenga e hiahia ana he kaihurihuri waiariki mahi teitei, e kiia ana he miihini PCR , e whakahaere tika ana i nga huringa pāmahana tere e hiahiatia ana hei whakaoho i ia wahanga o te tauhohenga.
Nga Waahanga Matua o te Rahui PCR
Te tauira DNA : Ko te tauira kei roto te raupapa i whainga.
DNA Polymerase : I te nuinga o te wa ko Taq polymerase, ka noho kaha ki te wera nui.
Primers : Whakamua me te whakamuri whenu e tautuhi ana i nga rohe whakakaha.
dNTPs : Ko nga turanga nucleotide e wha e mahi ana hei 'ink' mo te kape.
Buffer and Ions : Ka mau tonu te kaha me te pumau o te enzymatic.
He aha nga waahanga e 4 o te PCR?
Ko te tukanga PCR e wha nga waahanga mahi tuatahi: Te Whakakotahitanga, Te Denaturation, Te Aina, me te Toronga (e mohiotia ana ko te Elongation).
Ko te wahanga tuatahi, Ko te Whakatairanga, he huihuinga kotahi te wa ka whakamahanahia te ruuma tauhohenga ki te wera nui hei whakarite kia tino whakahohehia te DNA polymerase me te whakakore i nga mea poke. I muri mai i tenei, ka timata te huringa o te Denaturation, i reira ka wehea te DNA whenu-rua. Whai muri i tenei ko te Annealing, ka kitea e nga kaimatai o raatau whaainga, ka mutu ko Extension, kei reira te DNA hou e whakahiatotia ana. Ko tenei huringa e toru-taahiraa (Denaturation, Annealing, Extension) ka tuaruatia 25 ki te 40 nga wa.
Na te mea ka rererua te nui o te DNA ki nga huringa angitu katoa, he nui te tipu. Hei tauira, i muri i nga huringa e 30, ka taea te huri i te ngota ngota DNA kotahi neke atu i te kotahi piriona kape. Ko tenei whai hua ka puta ko nga kaieke hiko waiariki taiwhanga hou he mea tino nui mo te putaiao hou. Ki te kore e kitea nga poraka whakamahana me te whakamahana i roto i te -kounga teitei miihini PCR , ka tino puhoi te mahi mo te whakamahi i nga taiao tātaritanga teitei.
He aha nga hikoi miihini PCR?
Ko nga hikoi miihini PCR ka uru ki te paihikara aunoa o te pāmahana ma te mana hiko o te poraka waiariki, te whakahaere i te reiti rampa, te wa pupuri, me te whakamatao whakamutunga.
Ka mahi te miihini PCR ma te whakamahi i nga huānga Peltier kia tere te wera me te whakamatao i tetahi paraka whakarewa e pupuri ana i nga ngongo tauhohenga. Ko nga 'paahitanga' mai i te tirohanga a te miihini ko te 'Ramp,' ko te tere whakawhiti i waenga i nga mahana, me te 'Puri,' ko te roanga o te miihini e pupuri ana i te pāmahana motuhake. Ko nga miihini teitei kua hoahoatia kia tere rawa te reiti o te ramp ki te whakaiti i te wa e pau ana i te whakawhiti, ka whakaiti i te tupono o te herenga kore-motuhake, te paheketanga o te enzyme.
Ko te raupaparorohiko kei roto i te miihini ka taea e nga kaiwhakamahi te whakarite kawa uaua. Kei roto i tenei ko te whakamahana tuatahi, te tukuruatanga o nga wahanga matua e toru, me te hikoi pupuri whakamutunga i te pāmahana makariri (te nuinga o te 4°C) hei pupuri i nga tauira kia taea ra ano e te kaitoi te tiki mai. Ko nga atanga matihiko hou i runga i te miihini PCR ka taea hoki te aro turuki i te wa-tuuturu o te tauhohenga, me te whakarite kei te whai tonu te ahua o te waiariki kia rite ki te mea kua whakaritea mo te tino whakaputa.
He aha te pāmahana e whakamahia ana mo te taahiraa denature?
Ka whakamahia e te taahiraa denaturation te mahana i waenga i te 94°C me te 98°C hei whakangawari i te wehenga o nga here hauwai i waenga i nga whenu DNA.
I tenei wera nui, ka kore e tau te hanganga heliks-rua o te DNA. Ko nga here hauwai e mau ana i te adenine-thymine me te cytosine-guanine takirua ka rewa, ka puta mai e rua nga whenu motuhake o te DNA. He mea nui tenei mo nga mahi e whai ake nei, i te mea ka taea e nga papa tuatahi me te DNA polymerase enzyme te taunekeneke me nga tauira pae kotahi. Mēnā he iti rawa te pāmahana, karekau te DNA e tino wehe, ka arai i te rahua, i te koretake ranei o te whakakaha.
Heoi, ko te pupuri i tenei pāmahana ka hiahiatia he polymerase DNA tino pakari. Koinei te take i tino hurihanga te kitenga o te Taq polymerase, i wehea mai i te huakita aroha wera Thermus aquaticus . Ka whakakorehia nga enzyme paerewa i te 95°C, engari ka mau tonu a Taq. Me whakarite e nga taiwhanga ta ratou miihini PCR he whakamahana whakawera puta noa i nga puna katoa kia kore ai nga 'waahi makariri' kei te kore te whakahekenga, he ahuatanga matua o taputapu koiora rapoi kounga teitei.
He aha te mea ka tupu i te wa e mahi ana te PCR?
I te wa o te mahi annealing, ka whakahekehia te pāmahana ki waenga i te 50°C ki te 65°C, ka taea e nga papa tuatahi o te DNA te here ki o raatau raupapa taapiri i runga i nga tauira DNA whenu kotahi.
Ko tenei taahiraa ko te waahanga tino tairongo o te mahi PCR. Ko te pāmahana motuhake e whakamahia ana e whakawhirinaki ana ki te pāmahana rewa (Tm) o nga papa tuatahi e whakamahia ana. Mēnā he tiketike rawa te pāmahana, karekau ngā pūmua e here ki te tauira. Mēnā he iti rawa, ka herea pea ngā pūmua ki ngā raupapa e rite ana ki te 'waahanga' anake, ka puta ki te whakakaha kore-motuhake me nga hua kino. Me kaha te miihini PCR ki te pa atu ki tenei paemahana whainga me te tino tika (he maha i roto i te 0.1°C).
Ko te roanga o te hikoi whakaene i te nuinga o te 20 ki te 40 hēkona. I roto i tenei matapihi poto, ka whakaterehia e nga kaimatai te ranunga tauhohenga ma roto i nga nekehanga irapoi, ka mau ki te waahi kua tohua. I te wa e whakahiatotia ana nga mea tuatahi, ka hoatu he timatanga mo te DNA polymerase ki te whakauru i nga nucleotides. Ko tenei ruruku tika te mea e taea ai te kite i nga ira ira motuhake, i nga tukumate ranei i roto i te tauira koiora uaua, ka te whakangao ki nga miihini tātari ngaio he kaupapa matua mo nga taiwhanga haumanu.
He aha te pāmahana e whakamahia ana mo te taahiraa toronga?
Ko te taahiraa toronga ka mahia i te 72°C, koinei te pāmahana mahi tino pai mo te polymerase DNA-wera hei whakahiato i te whenu DNA hou.
I te 72°C, ko te DNA polymerase enzyme kei te tino pai. Ka timata i te waahi tuatahi ka timata ki te taapiri i nga dNTP ki te pito 3' o te tuatahi, ka neke haere i te whenu tauira. Ko te enzyme 'panui' ana i te tauira me te whakanoho i te turanga taapiri ki te whenu hou. Hei tauira, mena he Adenine te tauira, ka taapirihia e te polymerase he Timina. He mea whakamiharo te tere o tenei tauhohenga; Ka taea e Taq polymerase te taapiri i te 1,000 nga takirua turanga ia meneti.
Ko te roa o te wa mo tenei taahiraa ka whakawhirinaki ki te roa o te waahanga DNA e kapehia ana. Mēnā he 1,000 ngā takirua tūāpapa te roa o te raupapa whainga, ka whakaritea pea te taahiraa toronga mo te meneti kotahi. Mena he poto ake te whaainga, ka taea te whakaiti i te waa ki te penapena i te waa tukatuka katoa. Ko te whakarite kia mau tonu te miihini PCR i te 72°C puta noa i tenei wahanga he mea nui mo te whakaotinga o nga whenu DNA-katoa.
He aha te rere pāmahana PCR?
Ko te rere o te pāmahana PCR e whai ana i te hurihanga tukurua o te whakahekenga wera nui, te whakahekenga wera iti, me te toronga wera ngawari, ka hanga he tohu waiariki 'sawtooth'.
I hangaia tenei rerenga ki te whakanui ake i te ahu whakamua ahuahanga o te rahinga DNA. I roto i te oma angamaheni, ka timata te miihini i te 95°C mo te 2 meneti (Initial Denaturation), katahi ka uru ki roto i te kohanga: 95°C mo te 30 hēkona, 55°C mo te 30 hēkona, me te 72°C mo te 60 hēkona. E 30 nga wa e tukurua ana tenei koropiko. Ka mutu, he 'Torohanga Whakamutunga' i te 72°C mo te 5-10 meneti hei whakapumau i te katoa o te DNA whenu-tahi katoa ka tino paerua i mua i te whakamatao o te miihini ki te 4°C mo te rokiroki.
Ko te tika o tenei rerenga pāmahana ka pa ki te hua me te ma o te hua PCR. Ki te kore e rite te rere, ka ngaro pea te mahi o te enamaki, ka hanga ranei nga mea tuatahi i te 'dimer tuatahi', he taonga koretake o te tauhohenga. Na tenei, ko te whakamaarama me te riterite o te waiariki o te miihini PCR te mea tino nui mo tetahi taiwhanga e mahi ana i nga taatai rapoi, rangahau ranei.
Ripanga Whakarāpopoto o te Rere Pawera
| Wāhanga |
Paemahana Angamaheni |
Te kaupapa |
| Ko te timatanga |
94°C – 96°C |
Whakahohe ai i te whākōkī, ka whakateo i te DNA matatini. |
| Te whakahekenga |
94°C – 98°C |
Ka wehewehe i te DNA whenu-rua ki nga whenu kotahi. |
| Te whakaene |
50°C – 65°C |
Ka taea te piri tuatahi ki nga raupapatanga. |
| Toronga |
72°C |
Ko te DNA polymerase ka whakahiato i nga whenu DNA hou. |
| Pupuri Whakamutunga |
4°C – 10°C |
Te rokiroki mo te wa poto o te hua kua whakanuia. |
Whakamutunga
Ko te Polymerase Chain Reaction he taputapu huatau me te kaha kua huri te whenua o te aoiao koiora. Na roto i te whai i nga hikoinga o te denaturation, annealing, me te toronga, ka taea e nga kaiputaiao te iriti i nga mea ngaro kei roto i te DNA, ma te whakautu ki nga patai rongoa me nga paatai. Ko te angitu o tenei mahi ka whakawhirinaki nui ki te kounga o nga reagents me te tika o te miihini PCR e whakamahia ana hei whakahaere i nga huringa waiariki.
Mo nga taiwhanga e rapu ana ki te whakatutuki i nga hua rite me te pono, he mea nui te mohio ki nga ahuatanga o te whakahaere i te pāmahana me te whakahaere huringa. Ahakoa kei te whakahaere koe i te rangahau taketake, i te nui ranei o nga whakamatautau haumanu, ma te kowhiri i nga taputapu me te piri ki nga tikanga kua arotauhia ka whakatauhia te tika o to mahi. Mo te hunga e pirangi ana ki te taha arorau o te whakatuu taiwhanga irapoi, te tirotiro i te Ko nga utu me nga whakaritenga hangarau o nga punaha PCR hou ko te mahi arorau e whai ake nei ki te ahu whakamua i o kaha tātaritanga.
