Mmeghachi omume Chain Polymerase, nke a maara nke ọma dị ka PCR, na-anọchite anya otu n'ime ọganihu teknụzụ kachasị dị ịrịba ama na akụkọ ihe mere eme nke bayoloji molecular. Emebere ya na 1980s, usoro a esila na usoro ụlọ nyocha pụrụ iche gaa na ngwa ọrụ bụ isi nke ejiri na nyocha ahụike, sayensị nyocha, na nyocha mkpụrụ ndụ ihe nketa. Site n’ikwe ka ndị ọkà mmụta sayensị wepụta ntakịrị DNA ma mụbaa ya n’ime ọtụtụ nde mbipụta, PCR emewo ka o kwe omume inyocha mkpụrụ ndụ ihe nketa n’ụzọ zuru ezu, chọpụta ihe ndị na-akpata ọrịa nwere nnọọ nkenke, ma chọpụta akara mkpụrụ ndụ ihe nketa bụ́ ndị a na-adịghị ahụ anya na mbụ n’usoro usoro nyocha ọkọlọtọ.
Usoro PCR bụ usoro ụlọ nyocha a na-eji mee ọtụtụ mbipụta nke otu DNA kpọmkwem site na mgbanwe mgbanwe okpomọkụ, gụnyere denaturation, annealing, na ndọtị, nke igwe PCR pụrụ iche na DNA polymerase na-ekpo ọkụ na-akwado.
Ịghọta mgbagwoju anya nke usoro PCR dị mkpa maka ndị ọkachamara ụlọ nyocha, ndị nchọpụta ahụike, na ndị na-emepụta ụlọ ọrụ na-etinye aka na ngwá ọrụ nyocha. Dị ka ọchịchọ nke ngwa ngwa na ezi nwale molekul na-aga n'ihu na-eto eto n'ụwa nile, ntụkwasị obi nke Igwe PCR na-aghọ isi nkuku nke nsonaazụ ụlọ nyocha na-aga nke ọma. Edemede a na-enye ntụzịaka zuru oke maka usoro, ọnọdụ okpomọkụ, na usoro ihe achọrọ maka usoro PCR iji hụ na mmụba DNA dị elu yana nsonaazụ nnwale siri ike.
Isiokwu nchịkọta akụkọ
| Ngalaba |
Nchịkọta |
| Kedu ihe bụ PCR? |
PCR bụ usoro ihe omimi nke ihe omimi nke ejiri iji mekwuo usoro DNA dị iche iche maka ngwa dị iche iche. |
| Kedu ihe achọrọ maka PCR? |
PCR na-aga nke ọma chọrọ DNA ndebiri, primers, nucleotides, DNA polymerase kwụsiri ike, na igwe igwe ọkụ dị elu. |
| Kedu usoro 4 nke PCR? |
Usoro a na-eso usoro ezi uche dị na ya nke mbido, denaturation, annealing, na ndọtị iji mee ka ọdịnaya DNA okpukpu abụọ nke okirikiri nke ọ bụla. |
| Kedu ihe bụ usoro PCR igwe? |
Ngwa ahụ na-emezi mgbanwe mgbanwe okpomọkụ, na-ahụ na mmeghachi omume biochemical na-eme n'otu oge achọrọ. |
| Kedu ọnọdụ okpomọkụ a na-eji maka nzọụkwụ denatu? |
A na-eji okpomoku dị elu, nke na-adịkarị n'etiti 94°C na 98°C, mebie njikọ hydrogen na ikewapụ DNA nwere eriri abụọ. |
| Gịnị na-eme n'oge annealing nzọụkwụ? |
N'ime oge a, a na-ewetu okpomọkụ iji kwe ka primers jikọọ kpọmkwem na usoro ebumnuche ha na-akwado na DNA nwere otu eriri. |
| Kedu ọnọdụ okpomọkụ ejiri mee nzọụkwụ ndọtị? |
Nzọụkwụ a na-emekarị na 72 Celsius, okpomọkụ kachasị mma maka Taq polymerase iji mepụta eriri DNA ọhụrụ. |
| Gịnị bụ PCR okpomọkụ eruba? |
Ọsọ ahụ na-agụnye usoro ịgba ígwè ngwa ngwa nke okpomọkụ dị elu, dị ala na nke ọkara nke na-emegharị ruo mgbe a ga-erute ebe a chọrọ. |
Kedu ihe bụ PCR?
PCR, ma ọ bụ Polymerase Chain Reaction, bụ usoro ihe ndụ ndụ na-agbanwe agbanwe emebere iji mepụta ngwa ngwa ọtụtụ nde na ijeri ijeri DNA.
N'isi ya, PCR na-arụ ọrụ dị ka onye na-ese foto nke ihe ndị dị ndụ.' Tupu e mepụta ya, DNA na-amụbawanye bụ usoro dị nwayọ na nke siri ike nke gụnyere imechi DNA n'ime nje bacteria. Na biakwa obibia nke PCR igwe , ndị nchọpụta nwere ike ugbu a kewapụ otu mkpụrụ ndụ ihe nketa ma ọ bụ akụkụ nke genome ma gbasaa ya n'ime awa ole na ole. Ikike a dị oke mkpa n'ihi na ọtụtụ nyocha nke biochemical chọrọ nnukwu DNA iji nye mgbama enwere ike ịtụnye, na ihe nlele sitere n'okike na-enyekarị naanị ọnụọgụ.
Mgbanwe nke teknụzụ a na-egosipụta n'ụdị ngwa ya dị iche iche n'ofe ụlọ ọrụ dị iche iche. Na ntọala ụlọ ọgwụ, a na-eji ya chọpụta ibu nje, dị ka na COVID-19 ma ọ bụ nnwale HIV. Na forensics, ọ na-enye ndị nyocha ohere ịchọpụta ndị mmadụ n'otu n'otu site na nlele anya nke ihe ndị dị ndụ. Na mpaghara ụlọ ọrụ mmepụta ihe, PCR na-ahụ maka ịdị ọcha nke ngwaahịa nri na nchọpụta nke mkpụrụ ndụ ihe nketa gbanwere. Ịghọta ihe ụkpụrụ na ọnụ ahịa teknụzụ PCR dị oke mkpa maka ụlọ nyocha na-achọ ịkwalite ike nyocha ha.
Kedu ihe achọrọ maka PCR?
Mmeghachi omume PCR na-aga nke ọma chọrọ akụkụ ise: DNA template, kpọmkwem primers, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), DNA polymerase na-ekpo ọkụ (dị ka Taq), na ngwọta nchekwa pụrụ iche.
Ihe ndebiri DNA na-arụ ọrụ dị ka ụkpụrụ izizi nke ịchọrọ idetuo. Ndabere bụ mpempe DNA dị mkpụmkpụ, sịntetị nke emebere ka ọ dabara na mmalite na njedebe nke usoro ebumnuche. Enweghị ihe ndị a, DNA polymerase agaghị ama ebe ọ ga-amalite iwu eriri ọhụrụ ahụ. dNTP (A, T, C, na G) bụ ihe eji arụ ụlọ arụrụ arụ nke enzyme ahụ na-eji wuo yinye DNA ọhụrụ.
Ihe dịkwa mkpa bụ gburugburu ebe mmeghachi omume na-ewere ọnọdụ. Ihe nchekwa ahụ na-enye gburugburu kemịkalụ kwụsiri ike, ọkachasị na-elekwasị anya na pH na ntinye nke ion magnesium, nke bụ ihe dị mkpa maka DNA polymerase enzyme. N'ikpeazụ, mmezu anụ ahụ nke mmeghachi omume na-achọ onye na-arụ ọrụ ọkụ ọkụ na-arụ ọrụ dị elu, nke a na-akpọkarị PCR igwe , nke na-achịkwa kpọmkwem mgbanwe okpomọkụ ngwa ngwa dị mkpa iji kpalite ọkwa ọ bụla nke mmeghachi omume ahụ.
Ihe ndị dị mkpa nke ngwakọta PCR
DNA template : sample nwere usoro ebumnuche.
DNA Polymerase : Ọtụtụ mgbe Taq polymerase, nke na-anọgide na-arụ ọrụ na okpomọkụ dị elu.
Primers : Na-aga n'ihu na tụgharịa eriri na-akọwapụta oke mmụba.
dNTP : Ntọala nucleotide anọ na-arụ ọrụ dị ka 'ink' maka onye nbibi.
Buffer na ions : Na-ejigide arụmọrụ enzymatic na nkwụsi ike.
Kedu usoro 4 nke PCR?
Usoro PCR nwere usoro ọrụ anọ bụ isi: mmalite, Denaturation, Annealing, and Extension (nke a makwaara dị ka Elongation).
Nzọụkwụ mbụ, mmalite, bụ ihe omume otu oge ebe a na-eme ka ụlọ mmeghachi omume na-ekpo ọkụ na okpomọkụ dị elu iji hụ na DNA polymerase na-arụ ọrụ nke ọma na ihe ọ bụla na-emerụ emerụ na-ewepụ. Mgbe nke a gasịrị, okirikiri nke Denaturation na-amalite, ebe DNA nwere eriri abụọ na-ekewa. Nke a na-esote Annealing, ebe primers na-achọta ihe ha chọrọ, na n'ikpeazụ Extension, ebe DNA ọhụrụ na-emepụta. A na-emeghachi usoro usoro nzọụkwụ atọ a (Denaturation, Annealing, Extension) ugboro 25 ruo 40.
N'ihi na ọnụọgụ DNA na-eji okpukpu abụọ na usoro ọ bụla na-aga nke ọma, uto na-abawanye ụba. Dị ka ihe atụ, mgbe okirikiri 30 gachara, a pụrụ ime ka otu mkpụrụ ndụ DNA ghọọ ihe karịrị otu ijeri. Nke a arụmọrụ bụ ihe na-eme ọgbara ọhụrụ thermal cyclers dị oké mkpa maka sayensị ọgbara ọhụrụ. Na-enweghị ihe ọkụ ọkụ na-ekpo ọkụ na-ekpo ọkụ dị elu na-achọta na dị elu igwe PCR , usoro ahụ ga-adị ngwa ngwa maka iji ya mee ihe na gburugburu ebe nchọpụta nchọpụta dị elu.
Kedu ihe bụ usoro PCR igwe?
Nzọụkwụ igwe PCR na-agụnye ịnya igwe okpomọkụ na-akpaghị aka site na njikwa eletrọnịkị nke ihe mgbochi ọkụ, ijikwa ọnụego rampụ, oge ijide, na oyi ikpeazụ.
Igwe PCR na-arụ ọrụ site na iji ihe Peltier na-ekpo ọkụ ngwa ngwa ma mee ka ngọngọ ígwè na-ejide tubes mmeghachi omume. 'Szọụkwụ' site n'echiche igwe gụnyere 'Ramp,' nke bụ mgbanwe ọsọ n'etiti okpomọkụ, yana 'Jide,' nke bụ oge igwe na-ejigide okpomọkụ. Emebere igwe ndị dị elu ka ha nwee ọnụego rampụ ngwa ngwa iji belata oge etinyere na mgbanwe, nke na-ebelata ihe ize ndụ nke njikọta na-abụghị nke akọwapụtara ma ọ bụ mmebi enzyme.
Akụrụngwa dị n'ime igwe na-enye ndị ọrụ ohere ịme mmemme mgbagwoju anya. Nke a na-agụnye ikpo ọkụ nke mbụ, loops ugboro atọ nke isi ihe atọ, na nkwụsị ikpeazụ na okpomọkụ (na-emekarị 4 Celsius) iji chekwaa ihe nlele ahụ ruo mgbe onye na-ahụ maka ọrụ nwere ike weghachite ha. Ihe ntanetị dijitalụ ọgbara ọhụrụ na igwe PCR na-enye ohere maka nleba anya n'ezie nke mmeghachi omume ahụ, na-ahụ na a na-agbaso profaịlụ thermal kpọmkwem dị ka akwadoro maka mmeghari kachasị.
Kedu ọnọdụ okpomọkụ a na-eji maka nzọụkwụ denatu?
Nzọụkwụ denaturation na-ejikarị okpomọkụ dị n'etiti 94°C na 98°C iji kwado nbibi nke njikọ hydrogen n'etiti eriri DNA.
N'oge oke okpomọkụ a, nhazi nke helix abụọ nke DNA na-aghọ nke na-adịghị akwụsi ike. Njikọ hydrogen nke jikọtara ọnụ abụọ adenine-thymine na cytosine-guanine ọnụ gbazee, na-eme ka DNA abụọ nweere onwe ha. Nke a bụ ihe dị mkpa dị mkpa maka usoro na-esote, dị ka primers na DNA polymerase enzyme nwere ike ịmekọrịta naanị na ndebiri otu eriri. Ọ bụrụ na okpomọkụ dị oke ala, DNA agaghị ekewa n'ụzọ zuru ezu, na-eduga na mmụba dara ada ma ọ bụ na-adịghị arụ ọrụ.
Agbanyeghị, ijikwa ọnọdụ okpomọkụ a chọrọ DNA polymerase siri ike nke ukwuu. Nke a bụ ya mere nchọpụta nke Taq polymerase, nke dịpụrụ adịpụ site na nje na-ahụ ọkụ na-ekpo ọkụ Thermus aquaticus , bụ mgbanwe mgbanwe. A ga-ebibi enzymes ọkọlọtọ na 95 Celsius C, mana Taq ka na-arụ ọrụ. Ụlọ nyocha ga-ahụrịrị na ha igwe PCR na-enye kpo oku otu n'ofe olulu mmiri niile iji gbochie 'ebe oyi' ebe denaturation nwere ike ịda, nke bụ isi ihe dị na ya. akụrụngwa bayoloji dị elu dị elu.
Kedu ihe na-eme n'oge nkwụsị nke PCR?
N'oge mgbakasị ahụ, a na-ebelata okpomọkụ ruo n'etiti 50°C na 65°C, na-enye ohere ka DNA primers jikọọ na usoro nkwado ha na ndebiri DNA nwere otu eriri.
O doro anya na nzọụkwụ a bụ akụkụ kachasị emetụ n'ahụ nke usoro PCR. Ọnọdụ okpomọkụ a kapịrị ọnụ na-adabere na okpomọkụ na-agbaze (Tm) nke primers na-eji. Ọ bụrụ na okpomọkụ dị oke elu, primers agaghị ejikọta na template. Ọ bụrụ na ọ dị oke ala, primers nwere ike ijikọ na usoro nke naanị 'akụkụ ụfọdụ' yiri, na-eduga na nkwalite na-enweghị isi na nsonaazụ adịghị mma. Igwe PCR ga-enwerịrị ike iji oke nha nke ọma kụrie ọnọdụ okpomọkụ a (na-adịkarị n'ime 0.1°C).
Ogologo oge nkwụsịtụ ahụ na-abụkarị 20 ruo 40 sekọnd. N'oge mpio dị nkenke a, ndị na-emepụta ihe na-agagharị na ngwakọta mmeghachi omume site na mmegharị molekụla wee banye na saịtị ebumnuche. Ozugbo primers kwụsịrị, ha na-enye mmalite maka DNA polymerase ịmalite ịgbakwunye nucleotides. Nchikota nke ọma a bụ ihe na-enye ohere maka ịchọpụta mmụgharị mkpụrụ ndụ ihe nketa ma ọ bụ nje na-akpata n'ụdị nleba anya dị mgbagwoju anya, na-eme ka itinye ego na igwe nyocha ndị ọkachamara bụ ihe kacha mkpa maka ụlọ nyocha ụlọ ọgwụ.
Kedu ọnọdụ okpomọkụ ejiri mee nzọụkwụ ndọtị?
A na-eme usoro mgbatị ahụ n'ozuzu na 72 ° C, nke bụ okpomọkụ na-arụ ọrụ kachasị mma maka DNA polymerase na-ekpo ọkụ iji mejupụta eriri DNA ọhụrụ.
Na 72 Celsius C, DNA polymerase enzyme nọ na arụmọrụ kachasị elu. Ọ na-amalite na saịtị primer wee malite ịgbakwunye dNTP na njedebe 3' nke primer, na-aga n'ihu na eriri template. Enzyme ' na-agụ' ndebiri ma tinye ntọala nkwado na eriri ọhụrụ. Dịka ọmụmaatụ, ọ bụrụ na template nwere Adenine, polymerase na-agbakwụnye Thymine. Ọsọ nke mmeghachi omume a na-adọrọ mmasị; Taq polymerase nwere ike itinye ihe dị ka 1,000 isi ụzọ abụọ kwa nkeji.
Ogologo oge maka nzọụkwụ a dabere na ogologo akụkụ DNA a na-eṅomi. Ọ bụrụ na usoro ebumnuche bụ 1,000 isi ụzọ abụọ ogologo, enwere ike ịtọ usoro ndọtị ahụ maka otu nkeji. Ọ bụrụ na ebumnuche dị mkpụmkpụ, enwere ike belata oge iji chekwaa oge nhazi oge niile. Ịhụ na igwe PCR na-edobe 72°C na-aga n'ihu n'oge usoro a dị mkpa maka imecha eriri DNA zuru oke.
Gịnị bụ PCR okpomọkụ eruba?
Ntugharị okpomọkụ PCR na-esochi usoro nkwughachi nke oke okpomoku dị elu, ntanye ọkụ dị ala, na mgbatị ọkụ na-agafeghị oke, na-eke profaịlụ okpomọkụ 'sawtooth'.
Emebere eruba a ka ọ na-abawanye ọganihu geometric nke ọnụọgụ DNA. Na ọsọ ọsọ, igwe na-amalite na 95°C maka nkeji 2 (Mmalite Denaturation), wee banye akaghị: 95°C maka 30 sekọnd, 55°C maka 30 sekọnd, na 72°C maka 60 sekọnd. Nke a loop na-emegharị ugboro 30. N'ikpeazụ, e nwere 'Final Extension' na 72°C maka nkeji 5-10 iji hụ na DNA niile nwere otu eriri agbachie nke ọma tupu igwe ahụ ajụọ ruo 4°C maka nchekwa.
Nzizi oke okpomọkụ a na-emetụta mkpụrụ na ịdị ọcha nke ngwaahịa PCR. Ọ bụrụ na erute a na-ekwekọghị ekwekọ, enzyme ahụ nwere ike ịkwụsị ọrụ ya ma ọ bụ primers nwere ike ịmalite 'primer dimers,' nke bụ ihe na-abaghị uru nke mmeghachi omume. N'ihi nke a, nhazi na ịdị n'otu okpomọkụ nke igwe PCR bụ ihe kachasị mkpa maka ụlọ nyocha ọ bụla na-eme nchọpụta molecular ma ọ bụ nyocha.
Nchịkọta Tebụlụ Ntugharị Okpomọkụ
| Usoro |
Okpomọkụ a na-ahụkarị |
Ebumnuche |
| Mmalite |
94°C – 96°C |
Na-arụ ọrụ enzyme, na-ewepụ DNA mgbagwoju anya. |
| Denaturation |
94°C – 98°C |
Na-ekewa DNA nwere eriri abụọ n'ime otu eriri. |
| Na-ewe iwe |
50°C – 65°C |
Na-enye ohere ijikọ ngwa ngwa na usoro ebumnuche. |
| Mgbatị |
72°C |
DNA polymerase na-emepụta eriri DNA ọhụrụ. |
| Jide ikpeazụ |
4°C -10°C |
Nchekwa obere oge nke ngwaahịa emelitere. |
Mmechi
Mmeghachi omume Chain Polymerase bụ ngwa mara mma ma dị ike nke megharịala odida obodo nke sayensị ndu. Site n'ịgbaso usoro ezi uche dị na ya nke denaturation, annealing, and extensions, ndị ọkà mmụta sayensị nwere ike imeghe ihe nzuzo ndị dị n'ime DNA, na-enye azịza nye ajụjụ ndị dị mgbagwoju anya na ahụike na nyocha. Ọganihu nke usoro a na-adabere kpamkpam n'ịdị mma nke reagents na nkenke nke igwe PCR eji eme usoro okpomọkụ.
Maka ụlọ nyocha ọ bụla na-achọ iji nweta nsonaazụ na-agbanwe agbanwe na ntụkwasị obi, ịghọta nuances nke njikwa okpomọkụ na njikwa okirikiri dị mkpa. Ma ị na-eme nchọpụta bụ isi ma ọ bụ nyocha nyocha ụlọ ọgwụ dị elu, nhọrọ akụrụngwa na ịrapagidesi ike na ụkpụrụ ndị kachasị mma ga-akọwapụta izi ezi nke ọrụ gị. N'ihi na ndị nwere mmasị na logistical akụkụ nke ịtọ a molekụla lab, ịgagharị na Ọnụ ego na nkọwa teknụzụ nke sistemu PCR ọgbara ọhụrụ bụ nzọụkwụ ezi uche dị na ya n'ịkwalite ike nyocha gị.
